本文關(guān)鍵詞：抑癌基因Arid2對(duì)HBV病毒復(fù)制的調(diào)控及分子機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：乙型病毒性肝炎(Hepatitis B virus,HBV)是一種嚴(yán)重危害人類健康和生命的傳染性疾病,每年大約有100萬(wàn)人死于HBV相關(guān)性疾病。哺乳動(dòng)物酵母交換型轉(zhuǎn)換/蔗糖不發(fā)酵復(fù)合物(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting, SWI/SNF)是一種進(jìn)化保守的多亞基染色質(zhì)重塑復(fù)合物,其核心亞單位BRG1或BRM具有ATP酶活性。SWI/SNF復(fù)合物利用ATP水解所釋放的能量動(dòng)員核小體改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)從而調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。人類的SWI/SNF復(fù)合物分兩個(gè)亞型BAF(BRG1/hBRM-associated factors)和PBAF (Polybromo-associatedBAF),兩者僅有幾個(gè)組成亞基不同。Arid2基因編碼的BAF200是新近發(fā)現(xiàn)的SWI/SNF復(fù)合物核心亞單位PBAF中的一種特異性亞基。研究表明,病毒復(fù)制的過(guò)程同樣需要核染色質(zhì)重塑蛋白的參與,而作為PBAF中的一種特異性亞基,Arid2對(duì)病毒的復(fù)制也具有重要的調(diào)控作用,Easley等發(fā)現(xiàn)Arid2能夠影響人類免疫缺陷病毒長(zhǎng)末端重復(fù)序列(The human immunodeficiency virus type 1 long terminal repeat,HIV LTR)的轉(zhuǎn)錄活性從而調(diào)控病毒的復(fù)制。但是Arid2對(duì)HBV感染細(xì)胞中病毒復(fù)制的調(diào)控作用還未見相關(guān)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)旨在HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞系(HepG2-HBV1.1和HepG2.2.15)中觀察Arid2能否調(diào)控HBV的復(fù)制,并進(jìn)一步探尋Arid2調(diào)控HBV復(fù)制的相關(guān)分子機(jī)制。方法：1)在HBV復(fù)制的穩(wěn)定細(xì)胞系中通過(guò)Western blot和Southern blot檢測(cè)Arid2表達(dá)水平和HBV復(fù)制水平的相關(guān)性。2)在HBV穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系(HepG2-HBV1.1和HepG2.2.15)中,通過(guò)Southern blot、 Western blot、 qRT-PCR和ELISA法觀察沉默或過(guò)表達(dá)Arid2后HBV復(fù)制水平的變化。3)通過(guò)RT-PCR(?)qRT-PCR篩選沉默或過(guò)表達(dá)Arid2后可能影響HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子,并進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)、染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(chromatin immunoprecipitation,ChIP)深入研究Arid2調(diào)控HBV復(fù)制的分子機(jī)制。結(jié)果：Western blot 和Southern blot結(jié)果表明,在HBV穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系(HepG2.2.15.HepG2-HBV1.1和HepAD38)中,HBV的復(fù)制水平和Arid2基因的表達(dá)水平呈正相關(guān)。qRT-PCR和Southernblot結(jié)果證實(shí)：沉默Arid2基因的表達(dá)后,細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA拷貝量、pgRNA和HBcAg的表達(dá)量比對(duì)照組明顯降低(P0.05);ELISA方法檢測(cè)到siArid2組細(xì)胞上清中HBeAg表達(dá)降低(P0.05),但上清中HBsAg的表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P0.05)。通過(guò)RT-PCR篩選與HBV復(fù)制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,我們發(fā)現(xiàn)沉默Arid2基因的表達(dá)后,細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α的表達(dá)明顯下調(diào)。ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明,轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α能夠與HBV增強(qiáng)子結(jié)合,且主要與HBV Enhancer Ⅱ結(jié)合為主,沉默Arid2后轉(zhuǎn)錄因子P GC-1α與HBV增強(qiáng)子的結(jié)合水平明顯下降。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明,Arid2蛋白不能與轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α直接結(jié)合。反之,在過(guò)表達(dá)Arid2的細(xì)胞模型中,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA拷貝量、pgRNA和HBcAg的表達(dá)量與細(xì)胞上清中的]HBeAg表達(dá)量比對(duì)照組明顯增加,同時(shí),細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子PGC-1α的表達(dá)量也明顯增加。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)過(guò)表達(dá)Arid2后PGC-1α與HBV增強(qiáng)子的結(jié)合水平明顯增加。結(jié)論：在HBV復(fù)制狀態(tài)下,Arid2的表達(dá)水平與HBV復(fù)制水平呈正相關(guān)。Arid2主要通過(guò)調(diào)控PGC-1 α的表達(dá),并增強(qiáng)PGC-1α與HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控核心啟動(dòng)子區(qū)E nhancer Ⅱ的結(jié)合來(lái)調(diào)控HBV的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。
【關(guān)鍵詞】：HBV Arid2 HBV復(fù)制 轉(zhuǎn)錄因子 PGC-1α
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 第一部分 Arid2調(diào)控HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制的體外實(shí)驗(yàn)14-29
• 1 材料與方法14-17
• 2 結(jié)果17-26
• 3 討論26-29
• 第二部分 Arid2促進(jìn)HBV復(fù)制的機(jī)制研究29-40
• 1 材料與方法29-32
• 2 結(jié)果32-38
• 3 討論38-40
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 全文總結(jié)43-45
• 文獻(xiàn)綜述45-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 致謝53-54
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文54

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  本文關(guān)鍵詞：抑癌基因Arid2對(duì)HBV病毒復(fù)制的調(diào)控及分子機(jī)制研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：387538