本文關鍵詞：干擾素刺激基因I6（ISG16）的克隆表達及其對丙型肝炎病毒和I型干擾素信號通路的影響研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus, HCV)引起的慢性丙型肝炎是一種嚴重的傳染性肝臟疾病,目前全球感染者約1.5億。感染HCV后,只有20%的感染者可以自發(fā)清除病毒,而且HCV感染造成的慢性化程度較高,是引起肝硬化、肝纖維化以及肝癌的主要原因之一。丙型肝炎的標準治療方法是聚乙二醇干擾素(pegylated-interferon, PEG-IFN)聯合利巴韋林(Ribavirin, RBV),但是存在療程長、費用高、副作用大等缺陷。本課題組在前期研究中使用基因芯片技術從采用干擾素治療的丙肝患者有效和無效病人肝組織中篩選出18個差異表達基因,其中,在治療無效患者的治療前的肝穿組織中,干擾素刺激基因16(interferon-stimulated gene 16, ISG16)呈現高表達。ISG16是最早發(fā)現的能夠被Ⅰ型干擾素誘導的干擾素刺激基因之一但是ISG16對HCV復制以及Ⅰ型干擾素信號通路的影響還沒有相關研究。目的：在HCVcc體外培養(yǎng)細胞模型(Huh7.5.1細胞)和HCV復制子細胞(Conlb細胞)中高表達ISG16,研究ISG16高表達對HCV復制以及Ⅰ型干擾素抗病毒作用的影響;研究ISG16對Ⅰ型干擾素信號通路的影響；研究ISG16在經干擾素治療后有效和無效的丙型肝炎患者外周血單核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中的表達差異。最終闡明ISG16在HCV復制,干擾素抗HCV活性,Ⅰ型干擾素信號通路及HCV逃逸宿主先天免疫中的作用。方法：采用基因克隆方法構建ISG16高表達質粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16,轉染Huh7.5.1和Con1b細胞,采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Realtime-PCR)檢測ISG16、HCV以及其他ISGs的表達；采用蛋白質印跡法(Western Blot, WB)檢測ISG16蛋白表達和P-STAT1磷酸化水平；采用雙熒光報告基因法檢測干擾素刺激反應元件(interferon-stimulated response element, ISRE)的活性。以此探討ISG16對HCV復制、干擾素抗病毒作用以及Ⅰ型干擾素信號通路的影響。抽取經干擾素治療后的丙型肝炎患者的靜脈血,分離得到PBMCs,體外培養(yǎng)經Ⅰ型干擾素(IFN-a)刺激后,檢測PBMCs中ISG16的表達水平。結果：構建的ISG16高表達質粒,成功在Huh7.5.1和Con1b細胞中表達；ISG16高表達能夠促進HCV復制,抑制IFN-a抗病毒作用,對Ⅰ型干擾素信號通路中的關鍵點具有明顯影響：延長P-STAT1的磷酸化時間,抑制ISRE活性；在丙型肝炎患者PBMCs中,治療有效和無效之間的本底表達比較發(fā)現,治療無效者本底表達較高,但是由于樣本量較少,結果無顯著性差異,治療有效者經IFN-α刺激后,ISG16表達升高更顯著。結論：ISG16能夠促進HCV復制,抑制IFN-α的抗病毒作用,這種作用可能是通過影響I型干擾素信號通路中的關鍵點來實現的；丙肝病毒感染后導致ISG16表達升高,也許是HCV逃逸宿主先天免疫關鍵的分子機制之一。
【關鍵詞】：丙型肝炎病毒 干擾素刺激基因16 Ⅰ型干擾素信號通路 外周血單核細胞
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.63
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 前言9-17
• 1 丙型肝炎病毒研究現狀9-12
• 2 干擾素刺激基因1612-13
• 3 本研究的目的與意義13-14
• 4 本研究的技術路線14-17
• 實驗材料17-26
• 1 主要實驗儀器及耗材17-18
• 2 常用工具酶和試劑18-19
• 3 菌株及培養(yǎng)基19
• 4 細胞及培養(yǎng)基19-20
• 5 轉染質粒及載體20-22
• 6 Realtime PCR引物22
• 7 常用試劑配制方法22-24
• 8 主要試劑及來源用途24-26
• 實驗方法26-44
• 第一部分 ISG16基因的克隆和表達載體的構建26-33
• 1 ISG16基因目的片段的獲得26-29
• 2 目的片段與測序載體連接驗證片段正確性29-31
• 3 目的片段與表達載體連接31-33
• 第二部分 重組質粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16的真核表達驗證33-40
• 1 重組質粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16大量提取33-34
• 2 細胞株復蘇和培養(yǎng)以及轉染體系建立34-36
• 3 重組質粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16的真核表達驗證36-40
• 第三部分 重組質粒pcDNA3.1-3×tag-ISG16對丙型肝炎病毒以及干擾素信號通路的影響40-42
• 1 ISG16對丙型肝炎病毒復制以及IFN-α抗病毒作用的影響40-41
• 2 ISG16對干擾素信號通路的影響41-42
• 第四部分 ISG16在丙型肝炎病人外周血單核細胞PBMCs中的表達42-44
• 1 丙型肝炎病人外周血標本采集42
• 2 PBMCs的分離42-43
• 3 PBMCs培養(yǎng)和處理43
• 4 總RNA提取和Realtime-PCR檢測43-44
• 實驗結果44-52
• 1 pcDNA3.1-3×tag-ISG16質粒構建44-46
• 2 pcDNA3.1-3×tag-ISG16在肝癌細胞系中的高表達46-47
• 3 ISG16對HCV復制以及IFN-α抗病毒作用的影響47-48
• 4 ISG16對Ⅰ型干擾素信號通路的影響48-51
• 5 ISG16在慢性丙型肝炎患者PBMCs中的表達水平與干擾素治療療效的相關性研究51-52
• 討論52-55
• 結論55-56
• 附錄56-58
• 參考文獻58-62
• 文獻綜述62-73
• 參考文獻68-73
• 個人簡歷73-74
• 致謝74-75

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 Ulrich Spengler;Hans Dieter Nischalke;Jacob Nattermann;Christian P Strassburg;;Between Scylla and Charybdis:The role of the human immune system in the pathogenesis of hepatitis C[J];World Journal of Gastroenterology;2013年44期

中國博士學位論文全文數據庫 前2條

1 陳燕妮;微小RNA（miRNA）調控乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒基因表達和復制的分子機制研究[D];武漢大學;2011年

2 徐紹建;PCV2分子流行病學及其感染與JAK-STAT信號通路相互作用研究[D];山東農業(yè)大學;2013年

  本文關鍵詞：干擾素刺激基因I6（ISG16）的克隆表達及其對丙型肝炎病毒和I型干擾素信號通路的影響研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：374796