本文關鍵詞：梅毒螺旋體粘附素Tp0751重組菌影制備與免疫活性的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：[目的]構建重組梅毒螺旋體(Tp)黏附素Tp0751的大腸埃希菌菌影(EBG)(r Tp0751-EBG),檢測其免疫活性,為深入探討其在抗Tp感染中的潛在免疫保護作用奠定基礎。[方法](1)EBG的制備與鑒定:將含有噬菌體PHi X174裂解基因E的質粒p HH43轉化入E.coli DH5α,溫控誘導使其形成BG并計算裂解效率,瓊脂糖DNA電泳和透射電鏡(TEM)鑒定。(2)膜錨定載體的構建與表達:PCR擴增膜錨定基因E'(含linker),與p ET28a-Tp0751構建膜錨定載體p ET28a-E'-Tp0751,轉化E.coli BL21誘導表達,WB鑒定E'-Tp0751的表達。(3)r Tp0751-EBG表達質粒的構建:將含裂解基因盒E-box的p HH43與p ET-32a質粒酶切、連接,構建重組質粒p ET32a-E-box,再將其p ET28a-E'-Tp0751構建重組表達質粒p ET-28a-E'-Tp0751-E-box。(4)r Tp0751-EBG表達與鑒定:將p ET28a-E'-Tp0751-E-box轉化E.coli BL21,28℃誘導表達Tp0751,升溫至42℃熱誘導裂解,計算裂解率。WB鑒定Tp0751的表達;TEM鑒定BG。(5)動物免疫:分別用r Tp0751-EBG肌注、r Tp0751-EBG鼻滴、r Tp0751肌注(加弗氏佐劑)、EBG肌注及PBS肌注途徑免疫C57BL/6小鼠3次。每次免疫前及末次免疫后第10d收集血清和生殖道灌洗液,末次免疫后第10d制備小鼠脾細胞。(6)r Tp0751-EBG免疫活性測定:用間接ELISA法檢測血清特異性抗體Ig G抗體及生殖道灌洗液中s Ig A抗體水平,CCK-8法檢測r Tp0751刺激小鼠脾淋巴細胞增殖,間接ELISA檢測IFN-γ表達水平。[結果](1)EBG制備與鑒定:42℃下p HH43上E基因被激活導致E.coli裂解形成BG,裂解率可達98.13%;瓊脂糖凝膠電泳未觀察到DNA條帶,TEM顯示絕大部分細菌都裂解成空泡狀并保持細菌基本形態(tài)。(2)膜錨定載體的構建與表達:PCR擴增出大小約為180 bp左右的片段,與膜錨定基因E'一致;SDS-PAGE顯示一分子量約28KDa的可溶性蛋白,WB顯示該蛋白僅與Tp感染兔血清反應。(3)r Tp0751-EBG表達質粒的構建、表達與鑒定:酶切及測序結果表明含有目的基因Tp0751和裂解基因盒E-box的重組質粒構建成功。經28℃誘導表達一分子量約28 KDa大小的明顯條帶,WB顯示其僅與Tp感染兔血清反應。在42℃誘導重組BG的OD600值開始下降,裂解率為96.37%。TEM鑒定結果與EBG結果類似。(4)r Tp0751-EBG誘導系統(tǒng)和黏膜體液免疫應答水平:r Tp0751-EBG肌注組、r Tp0751-EBG鼻滴組和r Tp0751肌注組小鼠血清特異性Ig G水平隨免疫次數(shù)增加而增加,第4周達到最大值,抗體效價均高于1，

本文編號：369323