本文關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景及目的:結(jié)核病(TB)是我們?nèi)祟愐阎淖罟爬系膫魅静≈?結(jié)核分枝桿菌(M.tb)是主要致病因素,所以尋找有效的抗M.tb藥物或者疫苗一直是各國研究的重點(diǎn)之一。但是,至今其預(yù)防和治療仍不盡人意。雖然,現(xiàn)有的商業(yè)疫苗已經(jīng)有了卡介苗(BCG),其對(duì)于兒童感染的TB預(yù)防是有效的,尤其是較嚴(yán)重類型TB(如結(jié)核性腦膜炎、粟粒性結(jié)核病),但是其對(duì)保護(hù)成人肺結(jié)核方面缺乏穩(wěn)定性。目前對(duì)M.tb的研究主要是運(yùn)用M.tb的不同成分或者其自身分泌蛋白作為抗原,誘導(dǎo)不同的免疫細(xì)胞(γδT細(xì)胞、CD3+細(xì)胞等)發(fā)生反應(yīng),從而深入探究相關(guān)機(jī)制,以便于研制出新的疫苗或者抗TB藥物。M.tb的胞壁中的含有大量的脂類成分,它們就像一層厚厚的保護(hù)莢膜,既可以抵抗不利環(huán)境的侵害,也具有免疫調(diào)節(jié)作用,特別是在宿主固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)中均扮演重要的角色,所以這提示M.tb的脂類成分可以成為重要的抗M.tb疫苗或者藥物研究的靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)首先觀察,在體外培養(yǎng)結(jié)核桿菌裂解物刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的實(shí)驗(yàn)中,將胎牛血清(FBS)和人AB型血清作為培養(yǎng)液添加劑的效果比較。其次觀察,我們挑選的一些脂類抗原對(duì)人外周血中PBMC活化和增殖的作用,進(jìn)而探討脂類抗原在結(jié)核感染中是否存在特異性免疫作用。方法:(1)抽取健康成人外周血,分別加入結(jié)核桿菌全菌裂解物(WCL)或者同時(shí)給予人重組白細(xì)胞介素-2(rh IL—2)和植物血凝素(PHA),同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組,之后分別在含10%人AB型血清的RPMI1640培養(yǎng)液和10%FBS的RPMIl640培養(yǎng)液中培養(yǎng)6天后,用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)結(jié)果,運(yùn)用流式細(xì)胞儀(FCM)檢測淋巴細(xì)胞增殖情況。(2)運(yùn)用FCM和酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)分別檢測,從PBMC中分里出來的粘附細(xì)胞被IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)前后的表面抗原(CD11c,CD14,CD83)的表達(dá),同時(shí)再檢測已經(jīng)被誘導(dǎo)培養(yǎng)成非成熟的樹突狀細(xì)胞(im DCs)且被下列抗原WCL,全脂質(zhì)(TLIP),丙酮可溶性脂質(zhì)(ASLIP),純硫脂(PSLIP),脂阿拉伯糖(LAM),LM,培養(yǎng)液分泌蛋白(CFP),結(jié)核桿菌耐熱抗原(M.tb-HAg),磷酸脂多糖(LPS)和空白對(duì)照組刺激培養(yǎng)后的細(xì)胞表面抗原(CD83)表達(dá)和IL-12分泌情況。(3)運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)分別檢測,非粘附的PBMC(預(yù)先被CFSE標(biāo)記過)加入到抗原已經(jīng)刺激過的im DCs后,共同培養(yǎng)3天后用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測各組培養(yǎng)上清液內(nèi)TNF-α的濃度。當(dāng)培養(yǎng)到第9天,運(yùn)用FCM檢測各組PBMC的T細(xì)胞亞群(CD3,CD4,CD8,NKT和γδT)增殖和分泌IL-4,TNF-α和IFN-γ的情況。結(jié)果:(1)添加人AB型血清培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下,M.tb WCL對(duì)淋巴細(xì)胞增殖效果較同樣條件下添加FBS培養(yǎng)的增殖效果明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)用IL-4和GM-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)后的粘附細(xì)胞表面CD11c,CD14的比例相較于培養(yǎng)前的比例明顯下降,而表達(dá)CD1a的細(xì)胞比例則明顯上升,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)所有抗原在刺激im DCs后的成熟度標(biāo)記CD83的比例相較于空白對(duì)照組均有明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)除了ASLIP組外,其它抗原在刺激im DCs后,其分泌的IL-12的細(xì)胞數(shù)量相較于空白對(duì)照組均明顯增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)除了ASLIP和LM外,其它各抗原均能導(dǎo)致混合后的PBMC在培養(yǎng)3天后分泌TNF-α的濃度相較于空白對(duì)照組升高,而LM卻能導(dǎo)致PBMC分泌TNF-α的濃度相較于空白對(duì)照組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)PBMC培養(yǎng)至9天后,各抗原均能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞和NKT細(xì)胞增殖,M.tb-HAg能促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖,相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。(7)除了CFP和LM外,其它抗原均能促進(jìn)增殖的CD8+T細(xì)胞分泌TNF-α,而LM卻能起到抑制作用,相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。此外,除了WCL,TLIP和LM外,其它抗原均能促進(jìn)增殖的γδT細(xì)胞分泌TNF-α,相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。(8)所有抗原均能促進(jìn)增殖的CD8+T和CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ,而其中的WCL,ASLIP,M.tb-HAg,LM和LPS還能促進(jìn)增殖的γδT細(xì)胞分泌IFN-γ,相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。(9)除了TLIP,PSLIP外,其它抗原均能促進(jìn)未增殖的CD4+T細(xì)胞分泌IL-4,相較于空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意(P0.05)。結(jié)論:(1)當(dāng)以M.tb WCL為抗原的刺激人PBMC時(shí),淋巴細(xì)胞在添加人AB型血清培養(yǎng)液中比在添加FBS的培養(yǎng)液中增殖效果更加明顯。(2)我們所選的各類脂類抗原均能激活PBMC的特異性免疫反應(yīng),具有潛在的抗TB藥物和疫苗組分可能性。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 T淋巴細(xì)胞亞群 脂類抗原 細(xì)胞因子 DCs 人AB型血清 胎牛血清
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R52
【目錄】：

• 中英文縮略詞對(duì)照表7-10
• 中文摘要10-12
• ABSTRACT12-14
• 1 前言14-15
• 2 材料與方法15-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-20
• 2.1.1 結(jié)核分枝桿菌抗原及其配制15-16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的來源16
• 2.1.3 主要的試劑16-17
• 2.1.4 主要儀器和設(shè)備17-18
• 2.1.5 主要的試劑配制18-20
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法20-24
• 2.2.1 人AB型血清分離20
• 2.2.2 人外周血（全血）PBMC分離20
• 2.2.3 人外周血白細(xì)胞濃縮液中PBMC分離20-21
• 2.2.4 PBMC的凍存與復(fù)蘇21
• 2.2.5 CFSE和PI染色方法21
• 2.2.6 兩種血清對(duì)結(jié)核桿菌抗原培養(yǎng)的比較21-22
• 2.2.7 單核細(xì)胞的分離和誘導(dǎo)培養(yǎng)22
• 2.2.8 粘附細(xì)胞的培養(yǎng)前后檢測以及ELISPOT檢測IL-12的分泌22-23
• 2.2.9 ELISA檢測培養(yǎng)中的Ｔ淋巴細(xì)胞TNF-a含量23
• 2.2.10 培養(yǎng)后細(xì)胞增殖情況及其增殖亞群檢測23-24
• 2.2.11 培養(yǎng)后細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌情況的檢測24
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析24
• 3 結(jié)果24-38
• 3.1 兩種血清對(duì)結(jié)核桿菌抗原刺激人外周血細(xì)胞增殖的比較24-27
• 3.2 粘附細(xì)胞分離和誘導(dǎo)成功的流式細(xì)胞儀結(jié)果27-29
• 3.3 imDCs被多種抗原刺激后流失細(xì)胞儀檢測成熟度29-30
• 3.4 多種抗原刺激imDCs后ELISPOT檢測結(jié)果30-31
• 3.5 PBMC培養(yǎng)中的ELISA檢測結(jié)果31-32
• 3.6 抗原刺激擴(kuò)增培養(yǎng)后T細(xì)胞亞群增值情況32-34
• 3.7 抗原刺激擴(kuò)增培養(yǎng)后T細(xì)胞分泌IFN-γ，IL-4，TNF-α 的檢測34-38
• 4 討論38-40
• 5 結(jié)論40
• 6 參考文獻(xiàn)40-43
• 附錄43-44
• 綜述44-51
• 參考文獻(xiàn)49-51

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 林蘭;鄭亞琳;李鳴鏑;黃達(dá);;不同血清微環(huán)境培養(yǎng)的施萬細(xì)胞增殖狀況比較[J];醫(yī)學(xué)研究雜志;2013年08期

  本文關(guān)鍵詞：結(jié)核桿菌脂質(zhì)抗原對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞的作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：350041