【摘要】：目的:目前研究證實MAPK能夠增加Nrf2的核積聚,并進一步促進其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。但這種上下游的分子機制還未在細粒棘球蚴中證實。本實驗以體外培養(yǎng)的細粒棘球蚴原頭節(jié)為研究對象,探討細粒棘球蚴原頭節(jié)內(nèi)MAPK對Nrf2信號通路及其下游抗氧化酶表達的影響。方法:相對無菌環(huán)境下抽取細粒棘球蚴原頭節(jié),培養(yǎng)基培養(yǎng)3天后按具體實驗步驟分為以下各組:1.空白及丙泊酚模型對照組;2.0.5mM H_2O_2組;3.丙泊酚(0.5mM、0.75mM、1mM)預處理8h后加入0.5mM H_2O_2組;4.0.1mM ERK抑制劑PD98059、JNK抑制劑SP600125、P38抑制劑SB202190分別預處理2h后+1mM丙泊酚共培養(yǎng)8h,最后加入0.5mM H_2O_2培養(yǎng)6h組。藥物處理后,用伊紅染液對原頭節(jié)進行染色,普通光學顯微鏡下觀察原頭節(jié)染色情況,記錄3次實驗結(jié)果并繪制活力曲線圖。使用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定藥物作用后原頭節(jié)內(nèi)ROS水平及HO-1酶活性。蛋白免疫印記法(Western-blot)檢測原頭節(jié)內(nèi)Nrf2及HO-1蛋白表達量。結(jié)果:空白組及丙泊酚模型對照組原頭節(jié)活力無明顯變化。單獨使用0.5mM H_2O_2培養(yǎng)6h原頭節(jié)的活力為38%。丙泊酚(0.5、0.75、1mM)處理原頭節(jié)8h后,在新鮮的培養(yǎng)基中再加入0.5mM H_2O_2共培養(yǎng)6h。0.5 mM、0.75 mM和1 mM丙泊酚組對應原頭節(jié)存活率分別為48%,58%和65.5%。分別使用PD98059、SB202190、SP600125預處理原頭節(jié)2h,然后使用1mM的丙泊酚培養(yǎng)8h,最后加入H_2O_2共培養(yǎng)6h。原頭節(jié)活力分別為61%,36%,34%。與對照組相比原頭節(jié)活力明顯下降差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。使用熒光顯微鏡下觀察以下六組原頭節(jié)內(nèi)ROS的含量:與對照組相比H_2O_2及三種MAPK抑制劑明顯增加原頭節(jié)內(nèi)ROS含量,丙泊酚可以抑制原頭節(jié)內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P0.05)。HO-1試劑盒發(fā)現(xiàn)H_2O_2和丙泊酚提高HO-1酶活性,三種MAPK抑制劑均有不同程度的抑制作用,抑制p38及JNK信號通路對HO-1酶活性影響更大。Western-blot結(jié)果表明與對照組相比丙泊酚加H_2O_2組增加Nrf2及HO-1蛋白的表達,加入JNK、p38抑制劑后Nrf2及HO-1蛋白表達的作用被明顯抑制,ERK抑制劑抑制Nrf2及HO-1蛋白表達的作用較前兩者弱。結(jié)論:1.H_2O_2及MAPK抑制劑可抑制原頭節(jié)的活力,誘導原頭節(jié)內(nèi)ROS的產(chǎn)生。2.H_2O_2及丙泊酚促進原頭節(jié)中Nrf2與HO-1的表達,使用MAPK抑制劑后Nrf2及HO-1的表達明顯下降。
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R532.32
【圖文】：

酚及 MAPK 抑制劑對原頭節(jié)活力的影響下觀察并記錄不同實驗藥物作用后原頭節(jié)的存活處理后繪制活力曲線。首先通過實驗觀察丙泊酚別使用 0.25、0.5、0.75、1mM 的丙泊酚培養(yǎng)原活力均大于 95%，原頭節(jié)活力無明顯差異。從而（圖 1a）。單獨使用 0.5mM H2O2培養(yǎng) 6h 原頭 H2O2誘導原頭節(jié)凋亡的影響，用丙泊酚（0.5、新鮮的培養(yǎng)基中再加入 0.5mM H2O2共培養(yǎng) 6h。應原頭節(jié)存活率分別為 48%, 58%和 65.5%（圖計學意義（P<0.05）。為了探究 MAPK 與 Nrf2的作用，我們使用 H2O2作為細胞凋亡誘導物。用 PD98059、SB202190、SP600125 預處理原頭h，最后加入 H2O2共培養(yǎng) 6h。使用 0.1%的伊紅染（圖 2）。MAPK 抑制劑組與對照組之間原頭節(jié)）。綜上所述丙泊酚可以抑制 H2O2誘導原頭節(jié)的節(jié)的凋亡。

圖 2 ERK、p38、JNK 抑制劑體外作用后原頭節(jié)生長活力曲iability of protoscoleces incubated in vitro with inhibitors of Eb：0.5mM H2O2處理細粒棘球蚴原頭節(jié) 6h；c: 1mM 丙泊酚培養(yǎng)細粒棘球蚴原頭節(jié) 6h；d,e,f : 分別使用 ERK 抑制 抑制劑 SP600125 預處理原頭節(jié) 2h，然后加入 1mM 丙泊頭節(jié) 6h。酚和 MAPK 抑制劑對體外原頭節(jié)內(nèi) ROS 的2、丙泊酚、MAPK 抑制劑對體外原頭節(jié)內(nèi) ROS 的CFH-DA 探針孵育 1h，熒光顯微鏡下觀察原頭節(jié)內(nèi)示 H2O2及 MAPK 抑制劑明顯增加 ROS 的生成。丙產(chǎn)生，但是這種現(xiàn)象可被 MAPK 抑制劑阻斷。差 b

15圖 3 實驗藥物作用后原頭節(jié)內(nèi) ROS 的變化 3. ROS fluorescence intensity of protoscoleces after incubated with Experimental對照組；b: 1mM 丙泊酚預處理原頭節(jié) 8h 后加入 0.5mM H2O2培養(yǎng)細粒棘球蚴M H2O2處理細粒棘球蚴原頭節(jié) 6h；d,e,f : 分別使用 ERK 抑制 PD98059，90，JNK 抑制劑 SP600125 預處理原頭節(jié) 2h，然后加入 1mM 丙泊酚培養(yǎng)原頭O2孵育原頭節(jié) 6h。*與空白組比較（P<0.05）。PK 信號通路抑制原頭節(jié)內(nèi) Nrf2 及其下游 HO-1 的表達。了初步探討 MAPK 信號通路參與 Nrf2 及 HO-1 表達的分子機制，，使用 western-blot 檢測 Nrf2 及 HO-1 蛋白的表達量，Elisa 檢測 Hestern-blot 與 Elisa 兩種實驗方法得出的結(jié)果趨勢大體一致如圖 4 所白對照組相比丙泊酚明顯增加 Nrf2 及 HO-1 蛋白的表達，與加入 比 H2O2組 Nrf2 及 HO-1 蛋白表達增加，加入 P38 及 JNK 抑制劑進 Nrf2 及 HO-1 蛋白表達的作用被明顯抑制，加入 ERK 組 Nrf2 及微抑制。因此得出結(jié)論，細粒棘球蚴原頭節(jié)經(jīng)MAPK信號通路參與N

【參考文獻】

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本文編號：2804238