【摘要】：研究背景根據(jù)最新流行病學(xué)調(diào)查,目前全球約有2.5億人感染乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV),HBV感染仍然是一個(gè)嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題,其中部分慢性HBV感染者可進(jìn)展為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌(hepatocellar carcinoma,HCC),每年大約有超過(guò)100萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)疾病。HBV的高效復(fù)制及其逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程缺乏校正機(jī)制導(dǎo)致HBV在感染患者體內(nèi)以準(zhǔn)種(quasispecies,QS)的形式存在,即某一感染患者體內(nèi)的HBV病毒種群雖然在遺傳學(xué)上高度相關(guān),但病毒株間的基因組序列卻存在差異,這一種病毒形式的存在定義為QS。HBV準(zhǔn)種的特征和動(dòng)態(tài)變化模式與疾病臨床表現(xiàn)、抗病毒治療應(yīng)答和疫苗效果密切相關(guān)。了解HBV全長(zhǎng)基因組準(zhǔn)種的特征有助于患者抗病毒治療的個(gè)性化管理。目前對(duì)于HBV準(zhǔn)種的測(cè)序方法主要依賴聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)產(chǎn)物直接測(cè)序、PCR-克隆-測(cè)序(clone-based sequencing,CBS)以及二代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)技術(shù),其中直接PCR測(cè)序只能檢測(cè)到整個(gè)HBV準(zhǔn)種群中豐度為20%的突變,CBS被認(rèn)為是“金標(biāo)準(zhǔn)”,但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力,突變檢測(cè)敏感性取決于克隆數(shù)量,對(duì)于全長(zhǎng)準(zhǔn)種通常敏感性不高。二代測(cè)序在研究準(zhǔn)種方面較前兩種方法有明顯的優(yōu)勢(shì),但也有其不足,例如讀長(zhǎng)的限制,通常為100～300個(gè)堿基對(duì)(base pair,bp),且需要結(jié)合分子克隆的結(jié)果進(jìn)行判讀。隨著基因測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展,多種第三代測(cè)序(the third-generation sequencing,TGS)技術(shù)出現(xiàn),實(shí)現(xiàn)高通量測(cè)序的同時(shí)讀長(zhǎng)顯著增加,其中以單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(Single Molecule Real Time(SMRT)DNA sequencing technology)為突出代表,為 HBV 準(zhǔn)種研究提供了潛在的新研究方法。研究目的目前尚無(wú)三代測(cè)序應(yīng)用于HBV全長(zhǎng)準(zhǔn)種的相關(guān)檢測(cè)研究,本研究針對(duì)HBV全長(zhǎng)基因組準(zhǔn)種,通過(guò)比較PCR-克隆測(cè)序和三代測(cè)序,初步探討現(xiàn)有技術(shù)條件前提下,更適合于研究HBV全長(zhǎng)基因組準(zhǔn)種構(gòu)成和特性的方法。研究方法本研究共納入13例樣本,分為質(zhì)控組和實(shí)驗(yàn)組。質(zhì)控組3個(gè),命名為C01、C02、C03,由包含確定的不同比例的基因B型和C型HBV全基因克隆質(zhì)粒組成,實(shí)驗(yàn)組10例為2015年2月至2015年12月間就診于山東大學(xué)第二醫(yī)院符合《慢性乙型肝炎防治指南》的CHB患者。所有入組樣本均進(jìn)行HBVDNA抽提,PCR擴(kuò)增,應(yīng)用CBS及TGS方法測(cè)序,并用兩種方法所得測(cè)序結(jié)果分別分析HBV準(zhǔn)種的復(fù)雜度、離散度和HBV突變檢測(cè)等指標(biāo),以探討TGS在分析HBV準(zhǔn)種異質(zhì)性方面的效能和特點(diǎn)。研究結(jié)果兩種方法獲得的準(zhǔn)種克隆數(shù)量比較。平均每個(gè)樣本由CBS方法獲得的準(zhǔn)種克隆數(shù)為21.77±3.63個(gè),而TGS方法獲得的準(zhǔn)種克隆數(shù)為560.31±233.42個(gè),TGS方法獲得的準(zhǔn)種數(shù)遠(yuǎn)大于CBS方法(P0.01)。質(zhì)控組的結(jié)果表明兩種方法檢測(cè)到的準(zhǔn)種異質(zhì)性的比例均與預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)值相符,且TGS方法檢測(cè)準(zhǔn)種異質(zhì)性的比例比由CBS方法檢測(cè)得到的與預(yù)期標(biāo)準(zhǔn)值更加接近。質(zhì)控組從TGS方法獲得的準(zhǔn)種復(fù)雜度與從CBS方法獲得的準(zhǔn)種復(fù)雜度具有較好的一致性,均與準(zhǔn)種復(fù)雜度的理論值相符。試驗(yàn)組在分析準(zhǔn)種復(fù)雜度方面,利用配對(duì)t檢驗(yàn)(或者M(jìn)ann-Whitney檢驗(yàn)),除了核苷酸水平的PreS2區(qū)(P=0.021)和氨基酸水平的PreS1區(qū)(P=0.025)、PreS2區(qū)(P=0.019)外,HBV全長(zhǎng)基因組及其他分區(qū)兩種方法得到的準(zhǔn)種復(fù)雜度值沒有差異(P0.05)。在相關(guān)性分析中,除了 HBV全基因組外,各個(gè)分區(qū)的準(zhǔn)種復(fù)雜度值均呈正相關(guān)。在Bland-Altman一致性分析中,結(jié)果顯示除了 HBV全基因組(P = 0.13)外,HBV其他各個(gè)分區(qū)CBS和TGS有較高的一致性。在分析準(zhǔn)種離散度方面,利用配對(duì)t檢驗(yàn)(或者M(jìn)ann-Whitney檢驗(yàn)),除了核苷酸水平BCP區(qū)、X區(qū)(P值分別為0.044和0.021)的遺傳距離,S區(qū)的dS(P=0.030)外,HBV全長(zhǎng)基因組及其他分區(qū)的準(zhǔn)種復(fù)雜度值沒有差異(P0.05)。在相關(guān)性分析中,HBV全基因組及各個(gè)分區(qū)的準(zhǔn)種復(fù)雜度值均呈正相關(guān)。在Bland-Altman 一致性分析中,HBV全基因組及HBV其他各個(gè)分區(qū)CBS和TGS有較高的一致性。與基因B型標(biāo)準(zhǔn)序列D00330和基因C型標(biāo)準(zhǔn)序列AB033556進(jìn)行比對(duì),CBS共檢測(cè)出1101個(gè)變異,平均每位患者檢測(cè)到110.1±26.98個(gè)變異,TGS共檢測(cè)出3059個(gè)變異,平均每位患者檢測(cè)到305.9±162.45個(gè)變異。針對(duì)RT區(qū),S區(qū),C區(qū),X區(qū),PreC區(qū),BCP區(qū)文獻(xiàn)中已有報(bào)道的常見單核苷酸突變位點(diǎn),兩種方法共同檢出50個(gè)陽(yáng)性突變,陽(yáng)性率為15.15%。CBS方法沒有能夠單獨(dú)地檢測(cè)出陽(yáng)性突變,其陽(yáng)性率為0%。TGS單獨(dú)檢出40個(gè)陽(yáng)性突變,陽(yáng)性率為12.12%,明顯高于CBS(x2 =157.14,P0.01),表明TGS在突變檢測(cè)方面明顯敏感于CBS。在進(jìn)一步的Kappa 一致性檢驗(yàn)中,Kappa值為0.645,表明兩種方法在突變檢測(cè)方面的一致性為高度。對(duì)于聯(lián)合突變,A1762T/G1764A(5/10)和M204[Ⅰ/Ⅴ]/A1 81T(4/10)僅由TGS檢測(cè)出。由CBS和TGS方法獲得的HBV全長(zhǎng)病毒序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示兩株進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似,并且由TGS方法獲得的序列構(gòu)建的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)比CBS方法獲得的序列構(gòu)建的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)更加復(fù)雜。結(jié)論三代測(cè)序技術(shù)TGS在檢測(cè)HBV全長(zhǎng)準(zhǔn)種異質(zhì)性特征方面與“金標(biāo)準(zhǔn)”CBS具有良好的一致性。并且在準(zhǔn)種克隆數(shù)量和突變檢測(cè)的數(shù)量、敏感度方面均明顯優(yōu)于CBS。本研究初步認(rèn)為TGS適合于研究HBV全長(zhǎng)基因組準(zhǔn)種構(gòu)成和特性,并有高通量、高靈敏度及低成本的優(yōu)勢(shì)。以三代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床相關(guān)HBV全長(zhǎng)準(zhǔn)種特征值得進(jìn)一步研究。隨著基因測(cè)序技術(shù)提高和實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)一步地完善,檢測(cè)患者HBV全長(zhǎng)準(zhǔn)種特征將更加方便快捷并有望標(biāo)準(zhǔn)化,使臨床上針對(duì)不同準(zhǔn)種特征的HBV感染者開展個(gè)體化診療成為可能。
【圖文】：

Ｐ區(qū)，ＰｒｅＣ區(qū)，ＰｒｅＳｌ區(qū)，ＲＴ區(qū)，Ｓ區(qū)和Ｘ區(qū)兩種方法獲得的準(zhǔn)種復(fù)雜度值相逡逑比較沒有差異（尸＞０．０５，符合正態(tài)分布使用配對(duì)ｔ檢驗(yàn)，否則使用Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ逡逑檢驗(yàn)），見于附圖１。在氨基酸水平，Ｃ區(qū)，Ｐ區(qū)，ＰｒｅＣ區(qū)５ＲＴ區(qū)，Ｓ區(qū)，Ｘ區(qū)兩逡逑２４逡逑

Ｐ值分別為０．０２５和０．０１９。逡逑進(jìn)一步采用線性回歸模型評(píng)價(jià)兩種方法之間的相關(guān)性，，通過(guò)相關(guān)系數(shù)來(lái)反映逡逑兩種方法得到的準(zhǔn)種復(fù)雜度值線性關(guān)系的密切程度，見附圖２。無(wú)論在核苷酸水逡逑平還是氨基酸水平，，兩種方法獲得的在ＨＢＶ各個(gè)分區(qū)的準(zhǔn)種復(fù)雜度值均呈正相逡逑關(guān)（Ｒ２＞０．５，邋Ｐ＜０．０５），但是兩種方法獲得的ＨＢＶ全基因組準(zhǔn)種復(fù)雜度值無(wú)相關(guān)逡逑性（尸＝邋０．１３）。逡逑由于配對(duì)ｔ檢驗(yàn)和相關(guān)分析存在著對(duì)于隨機(jī)誤差和系統(tǒng)誤差的片面性，不能做逡逑到兩者的兼顧，因此選擇使用Ｂｌａｎｄ－Ａｌｔｍａｎ方法來(lái)進(jìn)行分析。因此，為了評(píng)價(jià)這逡逑兩種方法結(jié)果一致性，將通過(guò)直觀地觀察兩種方法所獲得的一致性界限的圖形逡逑（準(zhǔn)種復(fù)雜度值），借此來(lái)判斷ＣＢＳ和ＴＧＳ這兩種方法是否具有一致性，詳見附逡逑表３。統(tǒng)計(jì)的結(jié)果明確地提示除了ＨＢＶ全長(zhǎng)基因組之外，ＣＢＳ同ＴＧＳ比較有較高逡逑的一致性。逡逑但需要注意的是
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2700254