【摘要】：背景:母嬰傳播(Mother-to-Child transmission,MTCT)是我國乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)主要傳播方式及造成HBV慢性感染的主要原因。即使給予嬰兒乙肝疫苗及乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin,HBIG)主動-被動聯(lián)合免疫阻斷,仍有10%左右母親所生嬰兒發(fā)生HBV感染。研究HBV MTCT阻斷機制、明確MTCT阻斷失敗原因、探索及不斷完善阻斷策略是國內外學者共同關心的問題。母親高病毒血癥逐漸被證實是引起HBV MTCT阻斷失敗的主要原因,為降低母體HBV DNA載量,有研究提出妊娠期給予核苷(酸)類似物(Nucleos(t)ide Analogue,NA)抗病毒治療的建議。妊娠期應用抗病毒藥物治療可以分成兩種情況,一種是慢性HBV感染的患者在妊娠期出現肝功異常,丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)≥2×正常值上限(Upper Limit of Normal,ULN),進入HBV感染免疫清除期,需要隨時治療;另一種情況是肝功能正常的HBV攜帶者在妊娠末期應用抗病毒藥物來阻斷HBV MTCT。妊娠期抗病毒治療究竟能不能降低HBV MTCT的比例,藥物對于胎兒的影響及安全性究竟如何需要進一步的證實。而對于HBV感染免疫耐受期的孕婦來說,抗病毒治療究竟能不能起效,NA的干預能不能引起肝臟炎癥的激活尚不清楚,大量研究都建議產后1-3個月停藥,但是患者能不能哺乳,究竟什么時候停藥更合適、更安全,免疫耐受期的治療能不能增加病毒突變產生對NA的耐藥等,這些問題都沒有一致答案,臨床上還需要更多的循證醫(yī)學證據。因為HBV復制過程中所需的逆轉錄酶缺乏校正功能,HBV基因異質性廣泛存在,其中研究較多的是S基因變異對MTCT的影響。但在NA藥物臨床廣泛應用的選擇壓力下,HBV P基因尤其是逆轉錄酶(Reverse Transciptase,RT)區(qū)變異株從病毒準種中選擇出來并可能成為優(yōu)勢株而流行。而HBV P與S基因相互重疊,NA藥物治療后所產生的HBV P基因耐藥變異株流行能否直接影響乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)的特性和功能,從而產生新的免疫逃逸株,造成HBV MTCT阻斷失敗尚不清楚。目的:1、NA藥物替比夫定(Telbivudine,LdT)應用于HBV感染孕婦,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者和免疫耐受期高病毒血癥患者,評價其減少母嬰傳播的有效性,以及觀察胎兒及嬰兒出生后的安全性。2、HBV感染免疫耐受期高病毒血癥孕婦妊娠末期應用LdT治療,觀察其病毒學應答情況以及ALT升高肝炎激活的比例,以評價其療效和安全性,并探討停藥時機。3、比較HBV免疫阻斷失敗母-子/女與免疫阻斷成功母親HBV P/S基因變異特點,預測其變異導致蛋白質二級結構改變對于功能的影響。材料與方法:第一部分:LdT阻斷HBV MTCT有效性及嬰兒安全性的研究:這是一項前瞻、開放、多中心研究,選擇2011年1月—2014年4月就診于中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院感染科門診及沈陽市第六人民醫(yī)院肝病科門診的HBV感染孕婦,年齡19-45歲。若ALT正常的HBV攜帶孕婦,則需妊娠24周-32周,ALT≤40U/L,HBV DNA≥1×10~5IU/ml;若ALT升高的慢性乙型肝炎孕婦,則需ALT≥2×ULN,同時HBeAg陽性者HBV DNA≥20000IU/ml或HBeAg陰性者HBV DNA≥2000IU/ml,給予LdT600mg每日1次口服。所有嬰兒給予標準主-被動聯(lián)合免疫。若嬰兒7月齡時HBsAg陽性或HBV DNA陽性,則證實為免疫阻斷失敗,發(fā)生HBV MTCT。觀察HBV母嬰阻斷成功率、胎兒及嬰兒安全性。第二部分:HBV感染免疫耐受期孕婦應用LdT治療效果及停藥安全性的研究:上述研究對象中HBV攜帶免疫耐受期高病毒血癥(HBV DNA≥5 log_(10)IU/ml)患者:ALT正常(ALT≤40U/L),除外肝硬化。LdT抗病毒治療從妊娠24-32周開始直至分娩前。分娩前檢測HBV DNA載量,若HBV DNA陽性(HBV DNA20 IU/ml),分娩后立即停藥,停藥后1周孕婦即可哺乳;若HBV DNA陰性,分娩后繼續(xù)抗病毒治療。觀察孕婦治療過程中病毒學應答效果;ALT升高肝炎激活的比例,以評價孕婦的安全性。第三部分:HBV母嬰傳播免疫阻斷失敗母子基因異質性的研究:選擇2011年11月—2014年2月在中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院感染科就診的HBsAg(+)且HBV DNA(+)的10對母親及其子女,母嬰阻斷成功且HBV DNA(+)的18位母親作為研究對象,父親HBV血清標志物陰性。母親年齡為20歲-45歲;子女年齡為1歲-9歲,在出生時均接受乙型肝炎疫苗全程免疫,母親及其子女肝功能均正常,從未接受NA治療,留取其血清標本。上述標本檢測HBV DNA載量及提取DNA,行全P區(qū)基因測序。從NCBI的BLAST操作平臺,收集GenBank中的8條HBV DNA標準株。截取標準株與測序結果的精確同源位堿基序列,應用DNASTAR軟件分析,應用Megalign程序進行多序列比較及配對比較、同源性分析;Phylogenetic Tree進行基因分型;應用EditSeq進行氨基酸序列翻譯,判斷HBV血清型,應用Protean進行P/S區(qū)的蛋白質二級結構預測分析,選擇用Chou-Fasman方法進行蛋白質二級結構中α-螺旋、β-折疊和β-轉角的預測,采用Gamie-Robson方法進行無規(guī)則卷曲預測,采用Karplus-Schulz方法進行柔韌性分析,采用Jameson-Wolf方法進行抗原性分析。結果:第一部分:LdT阻斷HBV MTCT有效性及嬰兒安全性的研究:1)共納入治療組135例,其中ALT正�；颊�93例(93/135,68.89%),ALT≥2×ULN的CHB患者42例(42/135,31.11%),觀察組患者30例。135例治療組孕婦平均年齡為27.81±4.33歲(范圍:20-42),基線HBV DNA為7.82±1.04 log_(10)IU/ml(范圍:4.67-9.53),ALT平均值為89.2±134.27U/L(范圍:6-839)。平均開始治療的孕周為24.51±5.89周(范圍:4-38)。30例觀察組患者平均年齡27.43±4.88歲(范圍:19-39),基線HBV DNA為7.61±1.29 log_(10)IU/ml(范圍:5.11-9.72),ALT平均值為60.6±120.01U/L(范圍:9-582)。兩組各項基線值比較無差異。2)135例治療組患者中,有2例(2/135,1.48%)患者在治療5天及治療13天后分別發(fā)現胎兒唇裂及胎死宮內,這2例均為ALT升高的CHB患者。其余133例患者治療過程中監(jiān)測胎兒發(fā)育成長正常。共分娩134例嬰兒,所有嬰兒無先天畸形,出生時Apgar評分正常,發(fā)育良好。3)嬰兒出生后7個月,治療組HBV母嬰傳播率為0,而對照組中完成隨訪的21例患者中2例(2/21,9.52%)發(fā)生HBV感染,兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0220.05)。第二部分:HBV感染免疫耐受期孕婦應用LdT治療效果及停藥安全性的研究:1)91例孕婦接受LdT 600mg每日1次口服治療(治療組),26例孕婦未接受抗病毒治療(對照組)。治療組基線HBV DNA平均值為8.15±0.82 log_(10)IU/ml(range:5.54-9.53);治療1個月時,2例(2/91,2.20%)孕婦因HBV DNA較基線下降小于2 log_(10)IU/ml更換為替諾福韋酯(Tenofovir disoproxil fumarate,TDF)序貫治療;分娩前,HBV DNA較基線下降4.20 log_(10)IU/ml,平均值為3.95±0.94 log_(10)IU/ml(range:0-5.34)(P0.0001)。87例停藥患者在分娩后1個月HBV DNA反彈至8.06±0.83log_(10)IU/ml(range:5.22-8.95)。2)4例(4/91,4.40%)患者分娩后繼續(xù)治療,其中2例(2/91,2.20%)為分娩時HBV DNA陰轉,另2例(2/91,2.20%)為治療過程中ALT升高。其余87例(87/91,95.6%)患者分娩后立即停藥,僅3例(3/87,3.45%)發(fā)生停藥后ALT升高,其中2例為分娩后1個月ALT分別升至4×ULN和6×ULN,另外1例為分娩后3個月ALT升至16×ULN,3例停藥后ALT升高患者均無肝功能失代償表現,重新抗病毒治療1個月后ALT復常。第三部分:HBV母嬰傳播免疫阻斷失敗母子基因異質性的研究:1)10對免疫阻斷失敗母子/女中,母親(Failure Mother組,FM組)HBV DNA平均值為7.44±1.44 log_(10)IU/ml(范圍:5.82-8.86),子女(Child組,C組)HBV DNA平均值為7.56±0.96 log_(10)IU/ml(范圍:4.44-9.35),兩組間相比無顯著差異(P=0.3590.05)。而18位HBV母嬰阻斷成功母親(Successful Mother組,SM組)血清HBV DNA平均值為7.95±0.66 log_(10)IU/ml(范圍:6.41-8.92),與阻斷失敗母親血清HBV DNA相比無顯著差異(P=0.4530.05)。2)10對母子/女中母嬰基因型相同的9對,其中B基因型3對(M2-C2、M5-C5、M6-C6),C基因型6對(M1-C1、M3-C3、M4-C4、M7-C7、M8-C8、M9-C9),另有1對母嬰(M10-C10)基因型不同,分別為母親C型(M10)和女兒B型(C10)。10對母子血清型均為adr。而18位HBV免疫阻斷成功母親中基因B型4例(4/18,22.22%),基因C型14例(14/18,77.78%)。血清型則分別為adr 13例(13/18,72.22%),adw 5例(5/18,27.78%)。兩組在基因型和血清型上差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。10對免疫阻斷失敗母子/女中有4對同源性100%(M1-C1、M7-C7、M8-C8、M9-C9),均為基因C型;另外2例基因C型母子/女(M3-C3、M4-C4)同源性分別為99.7%和99.1%。而基因B型的3例母子/女(M2-C2、M5-C5、M6-C6)P基因同源性分別為99.3%、99%、98.8%。母女基因型不同的M10和C10同源性僅為94%。3)10對免疫阻斷失敗母子/女及18位免疫阻斷成功母親在HBV P基因RT區(qū)(nt130-1161)核苷酸序列高度一致,在NA容易導致的主要耐藥位點80、169、173、180、181、184、202、204、236、250無一例出現突變。但母嬰阻斷失敗3對母子/女在其他14個位點(14/1032,1.36%)出現了核苷酸點突變,其中4處有義突變?yōu)閚tA289T(C3)、ntC446G(M1/C1)、ntA895T(M3/C3、M9/C9)、ntG1114A(M9/C9),導致rtT54S、rtS106C、rtS256C、rtA329T氨基酸的變化。而蛋白質二級結構預測發(fā)現其在α-螺旋、β-折疊、β-轉角均與同基因型參考株有差異,導致分子量、長度、等電點及抗原性指數均有差異。S基因也出現N3S(M10)、A45T(C3)及L98V(M1/C1)變異,蛋白質二級結構預測分析顯示其抗原性指數較同基因型參考株有變化,但在HBsAg“a”決定簇(AA124-147)內并未發(fā)現變異。結論:1.妊娠期應用LdT抗病毒治療能顯著降低嬰兒HBV感染率,減少HBV MTCT;LdT抗病毒治療安全性好,嬰兒無嚴重不良反應發(fā)生。2.HBV感染高病毒血癥免疫耐受期孕婦在妊娠24-32周應用LdT治療可以有效降低母體HBV DNA載量;若孕婦在分娩前HBV DNA仍陽性,分娩后立即停藥安全,發(fā)生停藥后肝炎發(fā)作的比例低,再治療有效。3.HBV免疫阻斷失敗母親與子女與免疫阻斷成功母親相比,S基因存在“a”抗原決定簇以外的變異,N3S、A45T和L98V,這些變異能導致蛋白質二級結構發(fā)生改變。
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圖 2. 治療組完成治療的 133 例患者基線及分娩前 HBV DNA 變化組完成治療患者分娩前血清 HBV DNA 平均值為 2.99±1.78 log10IU/m（l范下降 4.83 log10IU/ml（P＜0.0001）。

圖 2. 治療組完成治療的 133 例患者基線及分娩前 HBV DNA 變化133 例治療組完成治療患者分娩前血清 HBV DNA 平均值為 2.99±1.78 log10IU/m（l范圍：0-5.34），，較基線值下降 4.83 log10IU/ml（P＜0.0001）。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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