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宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道抗病毒功能的發(fā)現(xiàn)與作用機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2020-04-13 20:34
【摘要】:病毒感染會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病,常常引起全球的關(guān)注、擔(dān)憂甚至恐慌。例如美洲出現(xiàn)了寨卡病毒(ZIKV)的爆發(fā)流行,其感染導(dǎo)致小頭畸形癥和格林-巴利綜合征。登革熱病毒(DENV)每年大約造成3.9億人口感染,導(dǎo)致登革熱、登革出血熱以及登革休克綜合癥等。丙型肝炎病毒(HCV)感染導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化和肝癌,全球大約有1.7億人感染。病毒作為絕對(duì)的細(xì)胞內(nèi)寄生生物,必須進(jìn)入宿主細(xì)胞才能啟動(dòng)復(fù)制、傳播和維持病毒感染。因此干擾病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞途徑阻止病毒感染,是一種高效、優(yōu)良的抗病毒策略。為了進(jìn)入宿主細(xì)胞,大多數(shù)病毒利用細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)器。病毒在細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)吞體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜等位置通過(guò)膜融合或侵入將病毒核酸釋放到細(xì)胞內(nèi),該融合或侵入過(guò)程通常與pH值相關(guān),而調(diào)節(jié)細(xì)胞和細(xì)胞器的pH值是離子通道的生理功能。顯然,離子通道在病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程應(yīng)該扮演了十分重要的角色。但是宿主離子通道和病毒感染之間的關(guān)系很少被探究。離子通道是細(xì)胞質(zhì)膜或者細(xì)胞器膜內(nèi)外物質(zhì)進(jìn)行離子交換的膜通道蛋白,對(duì)維持細(xì)胞的各種生理功能具有重要作用。Kv1.3鉀通道廣泛地分布在興奮與非興奮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞器膜表面,介導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜K+外流、細(xì)胞器膜K+內(nèi)流,對(duì)于維持靜息膜電位、調(diào)節(jié)膜的復(fù)極化、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞體積等至關(guān)重要。Kv1.3鉀通道異常表達(dá)與胰島素抗性、神經(jīng)退行性疾病、自身免疫性疾病、癌癥等密切相關(guān),因此Kv1.3鉀通道被作為多種疾病治療與診斷的靶標(biāo)。然而Kv1.3鉀通道和病毒感染之間的關(guān)系并不清楚。首先,本研究分析了馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3的基因表達(dá)與功能。采用蝎子細(xì)菌感染模型、啟動(dòng)子克隆與活性研究等,揭示了馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3為組成型轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。在HCV Huh7.5.1細(xì)胞感染體系中,BmKDfsin3能夠濃度依賴地抑制HCV復(fù)制,其IC50為2.34 μM。與此同時(shí),BmKDfsin3還具有Kv1.3鉀通道活性選擇性抑制功能,其IC50為23.4nM。過(guò)去我們課題組曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)Kv1.3鉀通道選擇性蝎毒素多肽抑制劑BmKTX-D33H和ADWX-1阻斷Kv1.3鉀通道活性的IC50分別為15.4pM和1.89pM,本研究發(fā)現(xiàn)它們也可以有效抑制HCV復(fù)制,其抑制HCV復(fù)制的IC50分別為1.22 μM和24.20 nM。研究暗示,Kv1.3鉀通道選擇性蝎毒素多肽抑制劑影響HCV復(fù)制可能具有普遍性,并且其抑制HCV復(fù)制功能與抑制Kv1.3通道活性功能呈正相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,以馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3為分子探針發(fā)現(xiàn)的Kv1.3鉀通道可能影響HCV復(fù)制。其次,研究了 Kv1.3鉀通道在HCV感染的人肝細(xì)胞系Huh7.5.1和肝組織中的表達(dá)與活性。RT-PCR、Western blot和免疫組化分析等揭示,在mRNA和蛋白質(zhì)水平上,人肝細(xì)胞系Huh7.5.1和肝臟組織均有Kv1.3鉀通道表達(dá)。采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),在Huh7.5.1細(xì)胞膜表面也能夠檢測(cè)到Kv1.3鉀通道電流。研究還發(fā)現(xiàn),HCV復(fù)制以不依賴于干擾素的方式上調(diào)Huh7.5.1細(xì)胞系中Kv1.3鉀通道的mRNA和蛋白含量,而且免疫組化分析顯示,HCV感染患者的肝組織中Kv1.3蛋白表達(dá)也升高了。同時(shí),在構(gòu)建的Kv1.3鉀通道穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的Huh7.5.1細(xì)胞系Kv1.3-stable中,HCV復(fù)制不僅上調(diào)Kv1.3鉀通道的mRNA和蛋白含量,而且也增強(qiáng)其細(xì)胞膜表面Kv1.3鉀通道電流。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)了 HCV復(fù)制能夠上調(diào)Kv1.3鉀通道的表達(dá)并增強(qiáng)宿主細(xì)胞膜Kv1.3鉀通道電流,暗示了宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道與HCV復(fù)制有十分緊密的聯(lián)系。然后,開(kāi)展了 Kv1.3鉀通道對(duì)HCV復(fù)制影響的研究。采用分子克隆、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、qRT-PCR和Western blot等技術(shù)在Huh7.5.1細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Kv1.3鉀通道,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,該通道的過(guò)表達(dá)會(huì)抑制HCV復(fù)制。同時(shí),將過(guò)表達(dá)的Kv1.3鉀通道下調(diào)可以回復(fù)其對(duì)HCV復(fù)制的抑制作用。并且,Kv1.3鉀通道基因的敲除促進(jìn)HCV復(fù)制。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道能夠有效地抑制HCV的復(fù)制。Kv1.3鉀通道抑制HCV復(fù)制的作用階段實(shí)驗(yàn)表明:Kv1.3鉀通道抑制HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程,不影響HCV病毒顆粒的完整性和感染性,不作用于HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞的吸附階段,而作用于HCV進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程的吸附后階段。利用電子透射顯微鏡技術(shù)觀察到Kv1.3鉀通道能夠?qū)CV顆粒阻滯在囊泡中。因此,這些研究表明,宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道能夠抑制HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞,且密切相關(guān)于病毒包膜與內(nèi)吞體膜融合階段。接著,本研究闡明了 Kv1.3鉀通道抑制HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞的作用機(jī)制。在Huh7.5.1細(xì)胞中,Kv1.3鉀通道定位于早期內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體、溶酶體等酸性細(xì)胞器上,且與HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程存在共定位。過(guò)表達(dá)Kv1.3鉀通道導(dǎo)致酸性細(xì)胞器pH升高。細(xì)胞與細(xì)胞膜融合研究發(fā)現(xiàn),Kv1.3鉀通道可以抑制HCV E1E2包膜蛋白介導(dǎo)的膜融合過(guò)程,而且過(guò)表達(dá)Kv1.3鉀通道可以放大酸性細(xì)胞器抑制細(xì)胞器膜融合。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道通過(guò)抑制內(nèi)吞體酸化過(guò)程影響HCV包膜與內(nèi)吞體膜的融合,從而阻止HCV的RNA基因組釋放到細(xì)胞質(zhì),最終限制HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞。最后,研究了 Kv1.3鉀通道限制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的廣譜性。黃病毒科包膜病毒DENV和ZIKV具有與HCV類(lèi)似的入胞過(guò)程,均經(jīng)由內(nèi)吞體酸化介導(dǎo)的膜融合過(guò)程進(jìn)入宿主細(xì)胞。qRT-PCR、Western blot、噬斑實(shí)驗(yàn)、透射電鏡和膜融合等實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道同樣可以影響病毒包膜與宿主細(xì)胞內(nèi)吞體膜的融合,從而有效抑制DENV和ZIKV的復(fù)制。與HCV、DENV和ZIKV不同,副粘液病毒科的包膜病毒SeV進(jìn)入細(xì)胞的膜融合過(guò)程是在中性pH條件和細(xì)胞質(zhì)膜表面發(fā)生。病毒RNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Kv1.3鉀通道并不影響SeV復(fù)制。因此,Kv1.3鉀通道是一個(gè)廣譜的限制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抗病毒蛋白,抑制經(jīng)由內(nèi)吞體酸化介導(dǎo)的膜融合過(guò)程進(jìn)入宿主細(xì)胞的一類(lèi)病毒的復(fù)制。綜上所述,本研究首先以馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3為分子探針,發(fā)現(xiàn)了宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道影響HCV復(fù)制的可能。然后,揭示了宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道具有抑制HCV入胞過(guò)程膜融合作用的功能,闡明了宿主細(xì)胞Kv1.3鉀通道通過(guò)影響內(nèi)吞體酸化抑制膜融合過(guò)程的抗HCV感染機(jī)制,并證明了 Kv1.3鉀通道是一個(gè)廣譜的限制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的抗病毒蛋白。本研究首次發(fā)現(xiàn)了Kv1.3鉀通道抑制病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程膜融合階段的新功能,為防治HCV、DENV和ZIKV等黃病毒甚至其它病毒感染提供了新的策略與途徑,也為宿主細(xì)胞離子通道作為廣譜抗病毒靶標(biāo)提供了理論基礎(chǔ)。
【圖文】:

馬氏,抑制活性,通道,半數(shù)抑制濃度


基于非脊椎動(dòng)物CSa(3防御素與a-KTx具有相似的空間結(jié)構(gòu),孟蘭霞(2017)逡逑利用NMR技術(shù)對(duì)與a-KTx氨基酸性質(zhì)最為接近的BmKDfsin3進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析逡逑(圖1.1),并研究了邋BmKDfsin3,邋4和5對(duì)不同鉀通道活性的抑制功能。最終發(fā)逡逑現(xiàn)BmKDfsin3能夠明顯抑制鉀通道Kvl.l、Kvl.2、Kvl.3和SK3通道活性,其逡逑中對(duì)Kvl.3通道抑制活性最好,半數(shù)抑制濃度為23.4邋士邋5.0邋nM;邋BmKDfsin4對(duì)逡逑Kvl.l、Kvl.2和Kvl.3通道具有明顯抑制活性,對(duì)Kvl.3通道抑制活性也最好,逡逑半數(shù)抑制濃度為510.2±邋161.2nM;邋BmKDfsin5只能抑制SK3活性。通道突變體逡逑研究發(fā)現(xiàn),BmKDfsin3作用于Kvl.3通道的孔區(qū)S5-S6邋linker。這是蝎防御素抑逡逑制離子通道活性功能的首次發(fā)現(xiàn),并且發(fā)現(xiàn)了馬氏正鉗蝎防御素BmKDfsin3作逡逑6逡逑

電壓門(mén)控,離子通道,通道,鉀通道


離子通道的開(kāi)放和關(guān)閉稱(chēng)為門(mén)控。門(mén)控性和離子選擇性是離子通道的兩大屬性。逡逑根據(jù)門(mén)控特性可將離子通道分為電壓門(mén)控離子通道、配體門(mén)控離子通道和其逡逑它類(lèi)型離子通道。電壓門(mén)控離子通道的分類(lèi)如圖1.2所示,,包括鉀通道、電壓門(mén)逡逑控鈉通道(voltage-gated邋sodium邋channels,Nav)、電壓門(mén)控鑰通道(voltage-gated逡逑calcium邋channels,VGCC邋或邋Cav)、瞬時(shí)受體勢(shì)通道(transient邋receptor邋potential逡逑channels,邋TRP)、CatSper和雙孔通道(CatSperandTPCs)、電壓門(mén)控質(zhì)子通道、逡逑阿諾定受體和環(huán)核苷酸調(diào)節(jié)通道(cyclicnudeotide-moduatedchannel,CNG)等。逡逑其中鉀通道又分為電壓門(mén)控鉀通道(voltage-gated邋potassium邋channels,Kv)、雙孔逡逑鉀通道(twoporepotassiumchannels,K2p)、內(nèi)向修復(fù)鉀通道(inwardlyrectifying逡逑potassium邋channels,Kir)、媽和鈉激活的鉀通道。配體門(mén)控離子通道包括酸敏感逡逑(質(zhì)子門(mén)控)離子通道(acid-sensing邋(proton-gated)邋ion邋channels
【學(xué)位授予單位】:武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類(lèi)號(hào)】:R511

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張宗明,裘法祖;離子通道與疾病[J];世界華人消化雜志;2005年05期

2 王剛,祝延,孔德虎,陳生弟;離子通道病研究的現(xiàn)狀和展望[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2004年03期



本文編號(hào):2626404

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