【摘要】：目的:研究布魯菌病患者和小鼠模型中T淋巴細胞亞群及其PD-1的表達變化及相關性,探討布魯菌感染機體后的免疫應答特征對疾病進展、預后的影響,為今后臨床對布魯菌病更有效的診斷和治療提供思路。方法:(1)通過Meta分析對我國布魯菌病患者的臨床表現(xiàn)、并發(fā)癥、誤診率和實驗室檢查進行了系統(tǒng)分析;同時還對國內(nèi)外有關布魯菌病患者外周血中T淋巴細胞比例變化的文獻進行了Meta分析。(2)對在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診的不同分期(急性、慢性及恢復期)的患者和健康對照進行分組,通過流式細胞術檢測外周血中T淋巴細胞亞群和PD-1的表達水平,采用流式液相多重蛋白定量技術檢測患者血清中T淋巴細胞因子的表達量,進行統(tǒng)計分析各項指標在不同分組間表達的差異及相關性。(3)使用布魯菌標準毒株16M通過腹腔注射法建立BALB/c小鼠感染布魯菌的動物模型,將小鼠分為三組:正常對照組,布魯菌感染模型組(Brucella),PD-1抗體干預組(Brucella+PD-1Ab),應用流式細胞術檢測小鼠不同感染階段PD-1在CD4+和CD8+T淋巴細胞表面的表達;采用流式液相多重蛋白定量技術的方法檢測不同感染時期小鼠T淋巴細胞相關細胞因子的表達水平;采用HE染色觀察小鼠感染后肝臟的病理,分析布魯菌感染狀態(tài)下PD-1對T淋巴細胞相關細胞因子的表達調(diào)控以及靶器官炎癥損傷發(fā)生的影響。結(jié)果:(1)關于我國布魯菌病患者臨床特征的Meta分析一共納入68篇文獻,共計報道了12842例患者,男女患者比例為(2.64∶1),79.4%的患者有明確接觸史,我國布魯菌病最常見的臨床癥狀是發(fā)熱、疲勞、關節(jié)痛、出汗和肌肉疼痛。布魯菌病患者會出現(xiàn)合并伴骨關節(jié)炎、肝炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、心血管疾病、呼吸道癥狀、睪丸炎或附睪炎、噬血細胞綜合征等并發(fā)癥。與成人患者相比,兒童患者皮疹和呼吸系統(tǒng)、心臟、睪丸炎、附睪炎等并發(fā)癥的發(fā)生率較高。寒戰(zhàn)、頭痛和體重下降的發(fā)病率較成人低。62.5%的患者在首次就診時發(fā)生誤診。常見的異常實驗室結(jié)果為白細胞減少,其他還有貧血、血小板減少、全血細胞減少以及白細胞增多。(2)患者外周血中T淋巴細胞比例變化的Meta分析共納入了8個研究,包括患者396例,健康對照212例。結(jié)果顯示患者CD4+T細胞比例和CD4+/CD8+T細胞比值低于健康對照組(P0.05),CD8+T細胞比例在患者組高于健康對照組(P0.05)。(3)本研究共收集了住院及門診的125例布魯菌感染患者病史及外周血標本,其中急性期患者47例、慢性期患者43例、恢復期患者35例,以及30名健康志愿者。急性期布魯菌患者CD4+T和CD8+T細胞表面PD-1的表達率高于慢性期、恢復期患者和健康對照(P0.05),其在慢性期患者中的表達要高于恢復期患者和健康對照(P0.05)。Th1細胞在急性期患者外周血中比例高于慢性期患者、恢復期患者和健康對照(P0.05)。慢性期患者中Th1的細胞比例要高于恢復期患者和健康對照(P0.05),恢復期患者停藥1年以內(nèi)Th1細胞比例仍高于健康對照(P0.05)。Th1細胞相關的細胞因子IL-2在急性期及恢復期患者中表達高于健康對照(P0.05),IFN-γ在急性期患者中表達顯著高于慢性期、恢復期及健康對照組(P0.05)。Th2細胞比例在慢性患者中最高,顯著高于急性期、恢復期與健康對照組,在急性期患者中表達比例高于恢復期與健康對照組(P0.05),在恢復期患者與健康對照組之間未見統(tǒng)計學差異(P0.05)。Th2細胞分泌為主的細胞因子IL-4表達水平在慢性期及恢復期患者中表達顯著高于急性期與健康對照組(P0.05),慢性期與恢復期患者間表達無顯著差異(P0.05),急性期患者表達高于健康對照組,有統(tǒng)計學差異(P0.05);細胞因子IL-5的表達在慢性期患者中高于急性期、恢復期患者及健康對照組(P0.05);細胞因子IL-13在慢性期患者中表達水平顯著高于急性期、恢復期患者及健康對照(P0.05)。Th17細胞比例在急性期與慢性期患者中表達均高于恢復期患者和健康對照(P0.05),急、慢性患者間表達未見顯著差異(P0.05)。Th17細胞分泌為主的細胞因子IL-17A的表達在急性期、慢性期及恢復期患者中表達無顯著差異(P0.05),在三組患者中表達均高于健康對照(P0.05);細胞因子IL-17F在慢性期患者中表達水平最高,顯著高于急性期、恢復期患者健康對照組(P0.05)。Treg細胞在急性期與慢性期患者中表達均高于恢復期患者和健康對照(P0.05),急、慢性患者間表達未見顯著差異(P0.05)。(4)通過攻毒4周后小鼠血清試管凝集試驗和小鼠脾臟細菌培養(yǎng)證實小鼠感染布魯菌模型建立成功,流式細胞術分析結(jié)果顯示,感染布魯菌2周后小鼠外周血中PD-1開始出現(xiàn)增高,感染4周后PD-1表達最高,于第8周出現(xiàn)下調(diào),隨后逐漸下降;Th1細胞因子IL-2、IFN-γ于感染2周即升高,IFN-γ在感染4周時表達達高峰,IL-2表達水平隨時間逐漸增高;Th2相關細胞因子IL-4、IL-5、IL-13在感染初期升高不明顯,在第8周后開始明顯升高;Th17相關細胞因子IL-17A在感染4周后表達逐漸增高,IL-17F在感染2周左右開始輕度增高。Th9相關細胞因子IL-9在感染4周開始增高,第8周表達水平達高峰;Th22型細胞因子IL-22于感染1周后升高,并持續(xù)維持在較高水平。IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17A的表達水平與感染時間正相關(P0.05),IL-5的表達水平與IL-13、IL-17A和IL-4的表達均呈正相關(P0.05),IL-17F與CD4+和CD8+T細胞表面的PD-1表達呈正相關(P0.05),CD4+與CD8+T細胞表面的PD-1表達正相關(P0.05)。布魯菌感染小鼠4周后可以觀察到肝臟組織出現(xiàn)水腫變性炎癥損傷,肝臟炎癥病變在8周時程度最重,隨著感染時間延長,肝臟炎癥損傷開始減輕。給予布魯氏桿菌感染小鼠PD-1抗體后,CD4+和CD8+T淋巴細胞表面PD-1表達水平下降(P0.05),PD-1抗體干預的小鼠在第4周時細胞因子IL-17和IL-9表達高于Brucella組(P0.05),IFN-γ表達水平低于Brucella組(P0.05)。第12周時Brucella+PD-1Ab組IL-13、IL-4、IFN-γ、IL-2和IL-9的表達水平低于Brucella組(P0.05),IL-17F和IL-22表達則顯著高于Brucella組(P0.05)。免疫組化結(jié)果顯示PD-1抗體處理組的感染小鼠肝臟炎癥損傷程度小。結(jié)論:(1)我國布魯菌病患者臨床表現(xiàn)復雜多樣,可累及多系統(tǒng),成人與兒童患者中臨床表現(xiàn)存在部分差異,布魯菌患者首診時易出現(xiàn)誤診,本研究為臨床準確及時診斷提供了一定的理論依據(jù)。(2)布魯菌病患者體內(nèi)存在明顯的免疫功能紊亂現(xiàn)象,CD4+和CD8+T細胞可能為影響布魯菌病進展的免疫因素。(3)患者感染布魯菌后在急性期以Th1、Th17和Treg細胞免疫為主,慢性期則由Th2、Th17和Treg細胞免疫為主導。同時觀察到患者在臨床治愈后短時間內(nèi)免疫功能尚未完全恢復,需要對恢復期患者長期隨訪。(4)布魯菌感染引起小鼠外周血中PD-1表達的增高,在感染初期主要以Th1和Th22細胞分泌為主的細胞因子增高,隨著病程進展,Th2、Th9、Th17和Th22細胞為主的免疫應答增強;布魯菌感染后可引起肝臟發(fā)生炎癥損傷,急性感染階段肝臟炎癥損傷較慢性感染階段程度重。PD-1抗體可減輕感染小鼠肝臟損傷,PD-1抗體在布魯菌感染時可調(diào)節(jié)Th1、Th2、Th17和Th9細胞相關細胞因子的表達,提示PD-1可能參與了布魯菌感染的細胞免疫調(diào)節(jié)。
【圖文】：

CD3+T細胞數(shù)據(jù)的漏斗圖

圖1-4 CD3+T細胞數(shù)據(jù)的 Egger圖Figure1-4 Egger diagram of CD3+T cell data文獻中，兩篇研究結(jié)果顯示布魯菌病患者組中CD3+T細獻研究結(jié)果示CD3+T細胞比例在患者組與健康對照組學異質(zhì)性較大（I2=85.6%，95% CI（72.4%；92.5%），模型進行分析（見圖1-5）。結(jié)果顯示：布魯菌病患病組對照組的趨勢，但兩者差異無統(tǒng)計學意義[MD=1.1319），P=0.3631]。所以，尚不能認為布魯菌病患病組照組。
【學位授予單位】：新疆醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R516.7

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本文編號：2621872