發(fā)布時(shí)間：2020-04-02 14:59

【摘要】：結(jié)核病是一種由結(jié)核分支桿菌引起的人畜共患傳染病,能夠引起大范圍感染、畸形甚至死亡。自2015年起,結(jié)核病超越艾滋病毒感染成為全球感染死亡的主要原因,每年均導(dǎo)致上百萬(wàn)人死亡和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于缺乏有效的治療方案,以及各種耐藥菌種的出現(xiàn),結(jié)核病的預(yù)防和治療仍是當(dāng)今世界面臨的主要難題之一。巨噬細(xì)胞是對(duì)抗入侵病菌的第一道防線,它能夠吞噬病菌,啟動(dòng)炎癥反應(yīng),指導(dǎo)適應(yīng)性免疫細(xì)胞,最終清除病菌、消除炎癥、恢復(fù)體內(nèi)平衡。然而,結(jié)核分支桿菌作為一個(gè)強(qiáng)大的胞內(nèi)寄生菌,在與宿主細(xì)胞的長(zhǎng)期對(duì)抗中,進(jìn)化出各種策略來躲避宿主的防御機(jī)制,并在巨噬細(xì)胞中建立合適的條件進(jìn)行生存和擴(kuò)散,將巨噬細(xì)胞作為其自然棲息地和在宿主中傳播的工具。因此,深入了解結(jié)核分支桿菌在巨噬細(xì)胞中引起的免疫反應(yīng)以及其逃避機(jī)制,對(duì)于開發(fā)有效的疫苗和針對(duì)持續(xù)性細(xì)胞內(nèi)感染的靶向免疫治療具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明,促炎性細(xì)胞因子IL-32在宿主對(duì)結(jié)核分支桿菌等病原體的防御中發(fā)揮著重要作用。由于選擇性剪接,IL-32存在多種剪接異構(gòu)體,可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能。其中,IL-32γ可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,激活維生素D抗菌通路等機(jī)制抑制細(xì)胞中結(jié)核分支桿菌的增殖。然而其他剪接異構(gòu)體對(duì)結(jié)核分支桿菌感染的影響還鮮有研究。因此,本研究深入探討了結(jié)核分支桿菌感染時(shí)巨噬細(xì)胞中IL-32對(duì)細(xì)菌增殖的影響,并描述了IL-32ε誘發(fā)抗菌效應(yīng)和細(xì)胞凋亡的潛在機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:1.本研究對(duì)結(jié)核分支桿菌感染前后巨噬細(xì)胞中IL-32不同剪接異構(gòu)體表達(dá)量變化進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,結(jié)核分支桿菌感染后,巨噬細(xì)胞中IL-32多種剪接異構(gòu)體均有表達(dá),然而表達(dá)水平差異顯著,其中攻菌后IL-32γ表達(dá)量最高,IL-32ε在攻菌前后表達(dá)量變化最大。2.由于結(jié)核分支桿菌能夠誘導(dǎo)IL-32多種剪接異構(gòu)體不同程度的表達(dá),因此本研究進(jìn)一步對(duì)這些剪接異構(gòu)體的抗結(jié)核作用進(jìn)行了探索。結(jié)果顯示,IL-32不同剪接異構(gòu)體對(duì)巨噬細(xì)胞中結(jié)核分支桿菌增殖的影響不同。其中,IL-32γ和IL-32ε實(shí)驗(yàn)全程均顯示出顯著的抗菌效果,IL-32β和IL-32δ于檢測(cè)的后半段對(duì)細(xì)菌的增殖也有不同程度的抑制,而IL-32α和IL-32ζ的抗菌效果并不顯著。3.鑒于細(xì)胞凋亡是IL-32抵抗結(jié)核分支桿菌感染的有效途徑,因此本研究進(jìn)一步探究了IL-32不同剪接異構(gòu)體對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示,IL-32不同剪接異構(gòu)體對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)能力存在差異。IL-32β、IL-32γ和IL-32ε對(duì)細(xì)胞凋亡率的上調(diào)極為顯著,IL-32δ僅微弱提高細(xì)胞凋亡率,而IL-32α和IL-32ζ對(duì)細(xì)胞凋亡沒有影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),區(qū)別于IL-32β和IL-32γ對(duì)Caspase-3的高活化率,IL-32ε過表達(dá)細(xì)胞中并未檢測(cè)到Caspase-3的激活。并且凋亡相關(guān)基因定量結(jié)果顯示,在IL-32ε過表達(dá)細(xì)胞中僅有Caspase-6和c-Myc表達(dá)上調(diào)。因此,本研究認(rèn)為IL-32ε通過不依賴于Caspase-3的機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。4.為了進(jìn)一步探究IL-32ε介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,本研究著重對(duì)IL-32ε與Nmi和β-catenin之間的相互聯(lián)系進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,IL-32ε能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中Nmi的表達(dá)。并且,利用siRNA敲降Nmi,能夠廢除IL-32ε介導(dǎo)的抗菌效應(yīng)和細(xì)胞凋亡。此外,IL-32ε過表達(dá)細(xì)胞中β-catenin蛋白水平顯著降低,在IL-32ε過表達(dá)細(xì)胞中補(bǔ)充β-catenin也能夠抑制IL-32ε介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。因此,本研究表明,IL-32ε通過上調(diào)Nmi表達(dá),降低細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白水平,引起細(xì)胞凋亡。5.為了探究IL-32ε誘導(dǎo)Nmi表達(dá)上調(diào)的機(jī)制,本研究通過雙熒光素酶報(bào)告分析逐步篩選出Nmi啟動(dòng)子中應(yīng)答IL-32ε誘導(dǎo)的核心區(qū)域,并深入研究找到了調(diào)控IL-32ε誘導(dǎo)Nmi轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Pax6和CP2。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),p38 MAPK在這一過程中起到橋梁作用,即IL-32ε通過激活p38 MAPK信號(hào)通路上調(diào)Pax6和CP2的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而上調(diào)Nmi表達(dá)水平,明確了IL-32ε誘導(dǎo)Nmi表達(dá)的機(jī)制。綜上所述,在巨噬細(xì)胞中,結(jié)核分支桿菌能夠誘導(dǎo)多種IL-32剪接異構(gòu)體的表達(dá),且不同剪接異構(gòu)體的抗菌能力存在差異。其中,結(jié)核分支桿菌誘導(dǎo)IL-32ε表達(dá),導(dǎo)致p38 MAPK信號(hào)通路激活以及轉(zhuǎn)錄因子Pax6和CP2活化,促進(jìn)了細(xì)胞中Nmi的表達(dá)。隨后,Nmi的上調(diào)使細(xì)胞中β-catenin蛋白水平下降,最終導(dǎo)致了依賴于Caspase-6和c-Myc的細(xì)胞凋亡。這一機(jī)制在巨噬細(xì)胞抵抗結(jié)核分支桿菌感染的過程中發(fā)揮著重要作用,可能為結(jié)核病的預(yù)防及治療提供了新的靶標(biāo)。
【圖文】：

3圖 1-1 結(jié)核分支桿菌在體內(nèi)的增殖過程(Russell et al., 2010)。Fig.1-1 The proliferation of Mycobacterium tuberculosis in vivo.1.1.4 結(jié)核病的治療與診斷活動(dòng)性結(jié)核病患者通常會(huì)出現(xiàn)肺部或全身癥狀，包括咳嗽、胸痛、疲勞和無意識(shí)的體重減輕。然而結(jié)核分支桿菌能夠長(zhǎng)期潛伏于有機(jī)體，大約 90%的感染以潛伏狀態(tài)存在(Zumla, 2013)。因此，臨床診斷的進(jìn)展對(duì)控制疾病的傳播至關(guān)重要。潛伏感染通常通過純化蛋白衍生物試驗(yàn)或 IFN 釋放分析進(jìn)行檢測(cè)(Al-Orainey, 2009)。而在活動(dòng)性感染中，建議采用胸片以及三份痰標(biāo)本的耐酸染色和培養(yǎng)進(jìn)行分析診斷(Dheda et al., 2016)。此外，疾病控制與預(yù)防中心建議對(duì)所有考慮診斷為結(jié)核分支桿菌感染的個(gè)體進(jìn)行呼吸道標(biāo)本的核酸擴(kuò)增。并且，如果臨床對(duì)感染的懷疑度很高，甚至在陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果出來

第一章 文獻(xiàn)綜述et al., 2012)。這個(gè)過程稱為胞葬，對(duì)炎癥的解決至關(guān)重要(Weiss and Schaible, 2015)。通過胞葬吞噬的含有結(jié)核分支桿菌的吞噬體隨后與溶酶體融合，導(dǎo)致了細(xì)菌更大范圍的降解(Martin et al., 2012)。細(xì)胞凋亡抗結(jié)核的機(jī)制是，將結(jié)核分支桿菌隔離在凋亡細(xì)胞中，阻止了細(xì)菌不可控的傳播，并抑制其毒力因子干擾吞噬體成熟。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體抗菌免疫應(yīng)答的中心，在抵抗結(jié)核分支桿菌感染和控制結(jié)核病進(jìn)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。事實(shí)上，，在與宿主細(xì)胞長(zhǎng)期的對(duì)抗中，結(jié)核分支桿菌進(jìn)化出一系列的策略來抵消宿主免疫應(yīng)答帶來的抗菌效果（圖 1-2），從而成功地在巨噬細(xì)胞中建立長(zhǎng)期生存的空間(Jayachandran et al., 2013)。這個(gè)對(duì)抗是長(zhǎng)期存在的，并且由于耐藥菌株尤其是多重耐藥（MDR）和廣譜耐藥（XDR）菌株的出現(xiàn)而變得更為復(fù)雜(Guirado et al., 2013; Warner and Mizrahi, 2013)。因此，明確了解特定病原體引起的宿主免疫反應(yīng)以及病原體的逃避機(jī)制，對(duì)于開發(fā)有效的疫苗和針對(duì)持續(xù)性細(xì)胞內(nèi)感染的靶向免疫治療具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R52

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本文編號(hào)：2612101