本文關(guān)鍵詞：恒河猴Tetherin基因cSNP及HIV-1適應(yīng)性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景：自然界中,病毒與宿主間存在協(xié)同進(jìn)化的現(xiàn)象。一方面,宿主不斷進(jìn)化出防御機(jī)制來(lái)抑制病毒入侵、復(fù)制等,另一方面,病毒針對(duì)宿主的防御機(jī)制也進(jìn)化出獨(dú)特的機(jī)能來(lái)規(guī)避宿主對(duì)它的抑制。協(xié)同進(jìn)化不僅促進(jìn)了兩個(gè)相互作用物種之間的適應(yīng)性,增加了生物的多樣性,同時(shí)也對(duì)病毒跨物種傳播帶來(lái)了很大阻礙。在人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)的研究中發(fā)現(xiàn),宿主細(xì)胞天然存在先天免疫因子,對(duì)病毒的侵入、復(fù)制和出芽存在限制作用。這些因子被稱為“宿主限制因子”,參與先天性免疫反應(yīng),干擾病毒生命周期的不同階段,達(dá)到對(duì)病毒的限制作用。目前已發(fā)現(xiàn)的限制因子有：APOBEC3G(apolipoprotein B mRNAediting enzyme 3G)、Trim5a (tripartite motif protein 5a)、Tetherin(也被稱做CD317或HM1.24)、SAMHD1 (sterile a motif domain and HD domain-containing protein 1) [4,5]。這些限制因子可有效地限制逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染,是宿主抵抗病毒感染的一個(gè)重要防御屏障。Tetherin是一種具有特殊拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的脂筏相關(guān)跨膜蛋白,它可通過(guò)連接病毒和宿主細(xì)胞膜,將新出芽的病毒束縛在細(xì)胞膜表面,從而限制病毒釋放。在恒河猴免疫缺陷病毒(SIV)／恒河猴實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的研究中,人們同樣發(fā)現(xiàn)了恒河猴細(xì)胞內(nèi)也存在Tetherin蛋白來(lái)抑制SIV在恒河猴體內(nèi)的擴(kuò)散。而且恒河猴的Tetherin基因具有一定多態(tài)性,但是對(duì)于恒河猴Tetherin基因多態(tài)性及其多態(tài)性對(duì)自身蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響并沒(méi)有明確報(bào)道。另一方面,Tetherin作為一種天然抗病毒蛋白,在不同的物種中,它的蛋白結(jié)構(gòu)也有所不同,具有物種特異性[2]。如果能使HIV跨過(guò)恒河猴Tetherin蛋白的限制作用,這可以成為對(duì)AIDS動(dòng)物模型優(yōu)化的重要一步。方法：本研究通過(guò)基因測(cè)序、序列比對(duì)、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等技術(shù),探尋恒河猴tetherin基因位置上可能影響其蛋白功能的cSNP位點(diǎn),再把不同基因型的tetherin插入到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(.)中,構(gòu)建不同基因型的tetherin表達(dá)載體。用不同基因型的tetherin表達(dá)載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,檢測(cè)轉(zhuǎn)染后SIV的病毒載量,以及流式檢測(cè)Tetherin基因在細(xì)胞表面的表達(dá)情況,最后對(duì)恒河猴進(jìn)行基因型的分類,比較不同基因型SIV感染恒河猴之間的病毒復(fù)制情況。另一方面,構(gòu)建表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL細(xì)胞系,通過(guò)HIV-1NL4-3在表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL與不表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL的混合細(xì)胞中培養(yǎng),在體外模擬自然進(jìn)化,最終使得HIV-1NL4-3能夠產(chǎn)生適應(yīng)性毒株,感染表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL,實(shí)現(xiàn)HIV-1NL4-3對(duì)恒河猴Tetherin限制作用的跨越。結(jié)果：序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)8個(gè)非同義突變位點(diǎn);用Psipred軟件預(yù)測(cè)分析,發(fā)現(xiàn)其中G41A、T128C、C129和A333C這四個(gè)cSNP位點(diǎn)會(huì)使Tetherin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在各基因型恒河猴tetherin表達(dá)載體與SIVmac239共轉(zhuǎn)染293T的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染不同tetherin表達(dá)載體的293T細(xì)胞表達(dá)SIV病毒的載量之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但是不同基因型恒河猴的tetherin基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞后Tetherin蛋白表達(dá)有所不同,GLQ和GPH型的恒河猴Tetherin蛋白表達(dá)要顯著高于DLQ和DPH型。在對(duì)不同基因型恒河猴的SIVmac239后病毒復(fù)制峰值和病毒復(fù)制控制值的比較中,發(fā)現(xiàn)DLQ基因型恒河猴病毒復(fù)制水平要高于GLQ型恒河猴(p0.05),其他基因型恒河猴的感染值之間沒(méi)有顯著差異。成功構(gòu)建表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL后,通過(guò)HIVNL4-3分別在表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中和不表達(dá)恒河猴Tetherin蛋白的TZM-BL中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),比較兩種細(xì)胞感染之間的病毒蛋白P24濃度以及活力,發(fā)現(xiàn)不同組別之間病毒P24濃度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：在中國(guó)恒河猴的tetherin基因中,我們發(fā)現(xiàn)了9個(gè)cSNP位點(diǎn),其中有四個(gè)cSNP位點(diǎn)(G41A、T128C、C129和A333C)可影響Tetherin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和恒河猴體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),恒河猴Tetherin基因的cSNP并沒(méi)有影響其抗病毒作用,但卻可以影響SIV對(duì)其拮抗作用。在HIVNL4-3對(duì)表達(dá)恒河猴Tetherin的TZM-BL的適應(yīng)性培養(yǎng)中,我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)恒河猴Tetherin蛋白對(duì)HIVNL4-3的抑制作用,但這并不能說(shuō)明恒河猴Tetherin蛋白對(duì)HIVNL4-3沒(méi)有抑制作用,雖然Tetherin蛋白可以把病毒束縛在宿主細(xì)胞表面,但我們不能排除病毒通過(guò)細(xì)胞與細(xì)胞之間的接觸反而使得病毒更容易發(fā)生擴(kuò)散。
【關(guān)鍵詞】：恒河猴 Tetherin cSNP SIV HIV
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.91
【目錄】：

• 英文縮寫(xiě)詞4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-12
• 第一部分 恒河猴猴tetherin基因編碼區(qū)單核苷酸多態(tài)性及其對(duì)蛋白功能的影響12-38
• 第一節(jié) 引言12-13
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料13-17
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法17-30
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-36
• 第五節(jié) 討論36-38
• 第二部分 HIV-1適應(yīng)性拮抗恒河猴Tetherin抗病毒作用的研究38-56
• 第一節(jié) 引言38-39
• 第二節(jié) 實(shí)驗(yàn)材料39-43
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)方法43-52
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-55
• 第五節(jié) 討論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-59
• 綜述59-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68
• 個(gè)人基本情況68-69
• 碩士期間論文發(fā)表情況69-70

【相似文獻(xiàn)】

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1 王冬平;隨麗華;洪寶慶;孫巖松;李慕;李桂軍;凡秀;;恒河猴與食蟹猴血液生理和生化指標(biāo)的比較[A];中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第七屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2006年

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本文編號(hào)：261080