本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌病實驗診斷方法評價及標準化研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：分析近10余年我國人間布魯氏菌病實驗室檢測方法的使用現(xiàn)狀,并對其敏感度和特異度進行評價；對三種原理不同的核酸提取方法提取核酸的效率及產(chǎn)物質(zhì)量進行比較；建立布氏菌熒光定量PCR及布氏菌含量的計算方法,探索應(yīng)用于布魯氏菌病診斷的可行性；為《布魯氏菌病診斷標準》的修訂提供技術(shù)支持。方法：按“布魯氏菌�。疾　焙汀皩嶒炇覚z查／診斷方法”關(guān)鍵詞組合,在萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺、中國知網(wǎng)、中文期刊數(shù)據(jù)庫(維普)等中文數(shù)據(jù)庫中檢索2004-2014年間有關(guān)布病實驗室檢測的文獻。統(tǒng)計各省份各檢測方法的檢測樣本量和各檢測方法的靈敏度、特異度及符合率。分別采用離心柱法(以TIANGEN細菌基因組提取試劑盒為代表)磁珠法(以Taco全DNA萃取試劑盒為代表)及水煮法提取濃度分別為1011、1010.5、1010、109.5、109 CFU/ml的布氏菌1 6M菌液,分別以50 μl、100 μl、200 μl(水煮法無洗脫步驟,不區(qū)分)的洗脫體積收集產(chǎn)物；用Nanodrop ND-1000分光光度計測量所提取核酸的濃度及純度等指標,并檢測各方法提取的核酸能否進行PCR及熒光定量PC。用平板計數(shù)確定布氏菌濃度,用此菌液建立PCR及熒光定量PCR的檢測方法,及通過熒光定量PCR推算臨床標本布氏菌濃度的參考系。并比較生理鹽水菌液與血清模擬樣本對熒光定量PCR檢測結(jié)果的影響,比較不同目的基因引物進行普通PCR的檢測下限差異。結(jié)果：1.篩選得到檢查樣本數(shù)量及方法相關(guān)文獻共157篇,其中實驗室檢查方法準確性相關(guān)文獻共22篇。由24個省份報告,實際樣本檢測時間為1954-2012年,共使用14種方法檢查了716280份樣本。2.檢測方法中,檢測樣本量由大到小為試管凝集試驗(SAT,256050份),虎紅平板凝集試驗(RBT,224699份),皮膚過敏試驗(184787份),平板凝集試驗(PAT,33018份)等。3.24個省使用SAT,20個省使用RBT,10個省使用皮膚過敏試驗,7個省分離布氏菌；檢測樣本量由大到小為河南(114031份)、內(nèi)蒙古(104287份)、浙江(93484份)；使用的檢測方法由多到少為浙江(9種)、內(nèi)蒙古(7種)、山東和黑龍江(5種)。4.各檢測方法與SAT的符合率最高的是膠體金,為99.77%(9811/9834)；其次為PAT,為97.73%(86/88)；雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(DAgS-ELISA),96.49%(110/114);RBT,94.55%(2 465/2 607)；人免疫球蛋白G酶聯(lián)免疫吸附試驗(IgG ELISA),86.38%(2068/2394);IgM ELISA,76.23%(1 825/2394);補體結(jié)合試驗(CFT),69.17%(83/120)；皮膚過敏試驗,56.36%(31/55)。5.在獲得核酸的產(chǎn)量上,離心柱法和磁珠法都遠低于水煮法,而離心柱法稍高于磁珠法。離心柱法和磁珠法在菌液濃度1011～1010.5CFU/ml可得到最高濃度的產(chǎn)物,水煮法所得產(chǎn)物濃度隨著菌液濃度的升高呈線性增加。離心柱法中,核酸濃度隨洗脫體積的增加而減少,但對總產(chǎn)量的影響不大,故洗脫體積在50 μ 1～200 μ 1范圍內(nèi)均可。磁珠法隨著洗脫體積的增加,核酸濃度下降得更快,即在50μ1時,總產(chǎn)量最高,2001x1時總產(chǎn)量最低。6.在純度上,水煮法最高(A260/A280、A260/A230比值最接近核酸對應(yīng)的標準范圍),離心柱法其次,磁珠法最低。7.三種方法重復(fù)性都很好,結(jié)果穩(wěn)定；且PCR和熒光定量PCR結(jié)果均為陽性。8.以b csp31作為目的基因,在108,～103CFU/ml范圍內(nèi)可得到熒光定量PCR典型擴增。Ct值在108～103CFU/ml范圍內(nèi)與菌液濃度的對數(shù)值呈線性,標準曲線,y=-3.0574x+46.171,R2=0.9968。9.生理鹽水菌液與血清模擬樣本熒光定量PCR的檢測下限相同,為103CFU/ml,各濃度Ct值沒有顯著差異。用B4/B5對兩種樣本進行普通PCR,檢測下限也相同,為106CFU/ml。10.用IS313/IS639、brucl/bruc5分別檢測菌液樣本。IS313/IS639檢測下限為105 CFU/ml,brucl/bruc5的檢測卜限為10CFU/ml。結(jié)論：1.SAT的應(yīng)用范圍最廣,此次研究所涉及的24個省份都采用了,且檢測樣本量也是最大。RBT的檢測樣本量及使用省份其次,且靈敏度特異度均達到94%以上。2.近十年,皮膚過敏試驗和PAT的使用單位相對RBT較少,檢查樣本量也小,分別為184787份及33018份。3.CFT、抗人免疫球蛋白試驗(Coomb's)操作繁瑣,使用范圍小,CFT僅一個省份出現(xiàn)了報道,Coomb's僅兩省報道,近十年檢查樣本量不足150份。4.膠體金操作簡便,可現(xiàn)場使用。檢測樣本量不大,只有浙江省報道。5. IgG ELISA的靈敏度、特異度均高,IgM ELISA靈敏度一般,但是可以分別檢測IgG及IgM,對布病病程判斷有一定參考價值。檢測樣本量不大,集中在內(nèi)蒙古、山東、北京。6.相比實驗室常用的離心柱核酸提取法,磁珠法操作簡單,重復(fù)性好,耗時短,所得核酸完整度高,可用于樣本量大且后接大片段核酸實驗研究。7.水煮法的產(chǎn)物濃度和純度都較高,耗時及費用低,重復(fù)性好,但核酸斷裂嚴重,適用于樣本量大,低成本,后接小片段PCR擴增時的核酸提取。8.菌液濃度的對數(shù)值與熒光定量PCR的Ct值滿足關(guān)系式y(tǒng)=-3.0574x+46.171,可用于估計患者標本中的布氏菌含量。9.熒光定量PCR可檢測布氏菌下限濃度為103CFU/ml,普通PCR檢測布氏菌下限濃度為106CFU/ml。10.普通PCR檢測IS313/IS639的檢測下限為105 CFU/ml,B4/B5檢測下限為106 CFU/ml, Brucl/Bruc5檢測下限為107 CFU/ml。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌病 診斷試驗 系統(tǒng)評價 布魯氏菌 核酸提取 熒光定量PCR PCR
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R516.7
【目錄】：

• 縮略詞6-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-21
• 第一部分 2004-2014年人間布魯氏菌病實驗室檢測方法系統(tǒng)評價21-31
• 1. 材料與方法21-23
• 2. 結(jié)果與分析23-27
• 3. 討論27-30
• 4. 小結(jié)與建議30-31
• 第二部分 三種方法提取布魯氏菌核酸的對比研究31-43
• 1. 實驗材料31-32
• 2. 實驗方法32-36
• 3. 結(jié)果36-40
• 4. 討論40-41
• 5. 小結(jié)41-43
• 第三部分 布魯氏菌PCR及熒光定量PCR臨床標本檢測43-54
• 1. 實驗材料43-44
• 2. 實驗方法44-47
• 3. 結(jié)果47-52
• 4. 討論52-53
• 5. 小結(jié)53-54
• 參考文獻54-58
• 附錄1：布魯氏菌病診斷標準送審稿58-74
• 附錄2：作者簡介74-75
• 致謝75

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本文編號：259271