【摘要】：20世紀70年代末，福氏志賀菌F4c亞型首次被前蘇聯(lián)科學家分離，并提示其可能成為優(yōu)勢流行菌株。自2003年10月起，我國多個省市均發(fā)現(xiàn)該菌的爆發(fā)或散發(fā)流行，且在部分省市呈逐年上升的趨勢，已成為部分地區(qū)細菌性痢疾流行的優(yōu)勢菌型。由于目前各地僅對局部的福氏志賀菌F4c亞型進行了分離鑒定，福氏志賀菌F4c亞型的整體情況及特征卻知之甚少。為全面了解其福氏志賀菌F4c亞型的生物學特性、流行特征和變異規(guī)律，本研究對2003年至2013年期間收集的來源于7個省市的F4c菌株進行了生化特征、血清學特征、毒力基因及耐藥譜進行生物學特征分析，對其脈沖場凝膠電泳（Pulsed—field gel electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型（Multilocus Sequenee Typing， MLST）、質粒圖譜進行分析，了解其分子分型特點，并對F4c亞型進行了全基因組測序，以期通過多種實驗方法深入了解我國福氏志賀菌F4c亞型的生物學特性、流行特征和變異規(guī)律，對于進一步研究細菌性痢疾的傳播流行規(guī)律及防控策略的制定和調整均有重要的科學意義。 本研究收集了2003年至2013年期間，包括北京、新疆、上海、甘肅、沈陽、廣西和河南等7個省及直轄市共30多家哨點醫(yī)院分離的204株福氏志賀菌F4c亞型。通過血清學鑒定、生化鑒定、藥物敏感實驗和毒力基因檢測，從204株F4c亞型中挑選出流行病學和遺傳背景無關的11株代表性菌株進行血清O抗原基因的鑒定，以全面了解其生物學特性。對204株福氏志賀菌F4c亞型進行PFGE分子分型；并從中選取不同地區(qū)、不同年份且毒力基因型別差異較大的60株進行質粒圖譜分析、37株進行MLST分子分型，選擇北京地區(qū)分離的1株福氏志賀菌F4c亞型進行全基因組測序。 日本Denka Seiken血清凝集實驗結果顯示：204株福氏F4c型菌株與福氏多價血清發(fā)生強凝集反應、與福氏Ⅳ型多價發(fā)生強凝集反應、與群因子血清7（8）發(fā)生凝集反應；但不與群因子血清（3）4、6發(fā)生血清凝集反應。血清抗原結構式為（Ⅳ：7，8），與文獻報告的F4c血清分型結果均相同。使用瑞典單克隆抗體血清（MASF）進一步細化血清學分型鑒定，結果顯示204株福氏F4c型菌株與血清群福氏多價B抗體呈凝集反應，與群因子血清7，8呈凝集反應，與群因子血清Ⅳ-1呈凝集反應，與其他各個型因子血清均不凝集，MASF血清鑒定結果MASF：B+，IV：I+，7（8）+；與FXv的MASF血清鑒定結果相同。另外，挑選11株代表性菌株鑒定其福氏4型和福氏X型部分血清O抗原特異性基因，結果發(fā)現(xiàn)本研究的福氏志賀菌F4c亞型100%攜帶福氏志賀菌wzx1-5型O抗原合成基因；100%攜帶O抗原修飾基因gtrX（葡萄糖基轉移酶基因）；100%不攜帶O抗原修飾基因gtrⅣ基因（葡萄糖基轉移酶基因）和oac基因（O-乙�；D移酶基因），F(xiàn)4c所攜帶的部分血清O抗原特異性基因與FXv相同。 204株福氏志賀菌F4c亞型的API-20E生化反應鑒定結果：以發(fā)酵葡萄糖、分解甘露醇為主，有四種生化反應結果存在差異，主要包括吲哚實驗，明膠液化實驗，蜜二糖實驗和阿拉伯糖實驗。204株福氏志賀菌F4c亞型中，吲哚實驗陽性菌株共有28株（占13.73%）；明膠液化實驗陽性菌株共有2株（占0.98%）；蜜二糖實驗陽性菌株共有26株（占12.75%）；阿拉伯糖實驗陽性菌株共有201株（占98.53%）。在204株福氏志賀菌F4c亞型中，吲哚實驗陽性菌株比例較高的地區(qū)是河南和沈陽，吲哚實驗陽性菌株最多的年份為2007年。蜜二糖實驗陽性菌株最多的地區(qū)為甘肅、河南和新疆，蜜二糖實驗陽性株最多的年份為2003年、2011年和2006年。明膠液化實驗陽性株均分離自廣西，具體年份不詳。阿拉伯糖陰性共有3株，分別為2004年新疆株、北京株和2007年上海株。其中，2株明膠液化實驗陽性菌株為首次在福氏志賀菌F4c亞型中發(fā)現(xiàn)。 2009年之后，國內報道的福氏志賀菌F4c亞型菌株對慶大霉素、妥布霉素和二、三代頭孢類抗生素抗生素的敏感率都呈明顯下降趨勢。本次對青霉素類抗生素氨芐西林敏感率僅為3.92%、哌拉西林的敏感率為75.49%；對β-內酰胺酶抑制劑復合物類藥物氨芐西林/舒巴坦的敏感率僅為4.41%、而哌拉西林/他唑巴坦的敏感率卻達100%；頭孢類抗生素敏感實驗的敏感率從76.96%～99.51%不等；三種氨基糖苷抗生素的敏感率達到84.8%以上；2種氟喹諾酮類抗生素的藥物敏感率分別為86.27%和88.24%；磺胺類（葉酸代謝途徑抑制劑）抗生素復方新諾明敏感率為29.41%；對呋喃妥因、氨曲南、亞胺培南敏感率96.08%。204株福氏志賀菌F4c亞型只有4株對20種抗生素全部敏感。另外，上海、甘肅、河南的多重耐藥率為100%，耐藥達到3種以上抗生素的菌株占全部菌株數(shù)量的77.45%。北京和上海兩地出現(xiàn)耐10種以上抗生素的菌株，北京耐10種以上抗生素菌株的比例為3.84%，而上海的比例為17.89%。 為了解福氏志賀菌F4c亞型的毒力基因攜帶情況，選取與福氏志賀菌相關的12對毒力基因進行檢測，攜帶全部12對毒力基因的菌株達158株（77.45%），ipaH1.4和shiD-Full基因在204株菌中的攜帶率為100%，ial基因的攜帶率最低，為86.27%。上海和廣西地區(qū)菌株的ial基因、ipaH基因的攜帶率低于其他地區(qū)的菌株。204株福氏志賀菌F4c亞型可按毒力基因的攜帶情況分為21個毒力基因型，其中1型占77.45%，是6個地區(qū)的優(yōu)勢毒力基因模式（廣西除外，廣西為4型和14）。結合生化結果分析發(fā)現(xiàn)，當吲哚實驗陽性或蜜二糖發(fā)酵陽性抑或阿拉伯糖發(fā)酵陰性時，福氏志賀菌F4c亞型的毒力基因攜帶率高，毒性比較強，且具有這種生化反應結果的菌株容易引起疫情暴發(fā)。另外，北京和上海兩個地區(qū)的菌株毒力基因的攜帶情況分析顯示：缺失ipaH9.8基因的福氏志賀菌F4c亞型頭孢類抗生素敏感率降低。 本研究選擇了60株毒力基因和抗生素敏感性差異比較明顯的F4c菌株進行質粒圖譜分析：該菌攜帶的質粒呈現(xiàn)多樣化，60株菌中21株攜帶220kb左右的大質粒，23株攜帶140kb左右的大質粒；60株菌中60株攜帶4.1kb的小質粒，56株菌攜帶2.2kb的小質粒，55株菌攜帶1.8kb的小質粒；不帶有10.5kb和4.8kb的小質粒；出現(xiàn)了1.0kb的小質粒。60株存在4.1kb小質粒的菌株均帶有毒力基因shiD-Full和ipaH1.4；7株缺失毒力基因ial、ipaH7.8和ipaH4.5的菌株具有3～5個不同的小質粒；27株ial基因陰性的菌株中，25株不具有大小在220kb的毒力大質粒。 本研究使用NotI限制性內切酶對204株福氏志賀菌F4c亞型進行PFGE分子分型分析。酶切片段在20kb至135kb之間，每株菌可得到大約14條左右的PFGE條帶。204株福氏志賀菌F4c亞型Dice系數(shù)在80%～100%之間，共生成81個帶型，優(yōu)勢帶型為FN11.004（31株，占15.20%）；可分為28個聚類型：聚類1型（FN11.001-FN11.023）共108株，占52.94%；聚類2型（FN11.024-FN11.029）共17株，，占8.33%；聚類4型（FN11.032-FN11.036）共8株，占3.92%；聚類10型（FN11.046-FN11.050）共7株，占3.43%；聚類18型（FN11.064-FN11.067）共9株，占4.41%；其余各聚類菌株數(shù)量均在5株以下。聚類分析發(fā)現(xiàn)2009年之前的菌株遺傳相似程度比較高，除河南以外（不排除河南菌株較少的原因），各地區(qū)菌株Dice系數(shù)均在80%~92%之間。北京地區(qū)、新疆地區(qū)和沈陽三地的F4c菌株優(yōu)勢帶型均為FN11.004；11株廣西地區(qū)F4c亞型分為11個帶型和7個聚類型。 多位點序列分析（MLST）分析發(fā)現(xiàn)：所有的F4c亞型菌株之間的等位基因值相同，均屬于相同的序列型ST245。從系統(tǒng)進化圖分析，ST245與ST651、ST633、ST627、ST255和ST240等屬于ST245Cplx，只有1個位點的變異，遺傳距離較近，可以說明它們之間的親緣關系也較近。ST629、ST631、ST264和ST248、ST630也屬于ST245Cplx，有2-3個位點的變異，ST245Cplx極有可能由ST270的EIEC進化而來。 全基因組測序后的結果分析顯示，福氏志賀菌F4c亞型與參考菌株福氏志賀菌FXv亞型O抗原序列相似度較高，但F4c還有來源于F2a和大腸等及其他菌型的基因和質粒，這些差別到底會對福氏志賀菌F4c亞型的致病性和表型產(chǎn)生多大影響尚未得知，但目前分析的結果至少提示F4c與FXv為同一血清型，可能屬于同一血清型的不同基因型。 本次分析的福氏志賀菌F4c亞型O抗原特異性基因gtrX陽性，與Fx及Fxv相同，而血清凝集實驗為福氏4型，與FX及FXv均不相同，可能命名為F4型或F4v型比較合適。本次研究的福氏志賀菌F4c亞型菌株發(fā)酵葡萄糖，甘露醇實驗陽性，并首次檢出來源于廣西的明膠液化陽性菌株。我國福氏志賀菌F4c亞型對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦普遍耐藥，對哌拉西林、復方新諾明、慶大霉素、妥布霉素和二、三代頭孢類抗生素的耐藥率也呈逐年上升的趨勢，對喹諾酮類抗生素敏感。北京地區(qū)我國福氏志賀菌F4c亞型耐藥率低，毒力基因攜帶率高；而上海地區(qū)則耐藥率高，毒力基因攜帶率低。上海及廣西毒力基因攜帶率低于其他地區(qū)。福氏志賀菌F4c亞型主要攜帶220kb和140kb二種大質粒；4.1kb，2.2kb和1.8kb三種小質粒。204株菌分為81個型，優(yōu)勢帶型為FN11.004型。新疆，北京，沈陽優(yōu)勢帶型相同。MLST分型為ST245型。福氏志賀菌F4c亞型與參考菌株福氏志賀菌FXv亞型O抗原序列基本一致，二者為相同血清型。
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事醫(yī)學科學院碩士學位論文 第一部分 我國福氏志賀菌 F4c 亞型的表型及生物學因此，本研究 204 株福氏志賀菌 F4c 亞型的日本生研血清和 MASF 血集反應結果，與孫強正等[34]研究的 FXv 的血清學實驗的文獻報道結果沒。2 血清 O 抗原特異性基因2.1 血清 O 抗原部分特異性基因 PCR 產(chǎn)物電泳圖（圖 1）M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

圖 1-1 O 抗原特異性基因 PCR 電泳結果(左：gtrIV；右：oac)：DL2000； 1：陰性對照； 2：HN5； 3：2008069； 4：2011178； 5：201002004060； 7：1040； 8：SH12sh017； 9：230408； 10：XJ2006-135； X-C386； 12：GX-C919M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mbp20001000750500250100M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R516.4

【參考文獻】

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3 孫永祥,金以森,章堅,陸扁,毛建勛,丁水軍;福氏志賀菌4c亞型的藥物抗性觀察[J];國外醫(yī)學.流行病學傳染病學分冊;2005年05期

4 程均福;朱群力;張少敏;呂靜;侯學霞;劉公平;劉力;;湖北省部分志賀氏菌基因檢測結果分析[J];公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學;2012年06期

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9 常偉冰;吳國強;;1株福氏志賀菌4c型檢出報告[J];江蘇預防醫(yī)學;2010年03期

10 滕國棟;陳敏亮;;全基因組測序技術的發(fā)展和應用[J];中國美容醫(yī)學;2013年04期

本文編號：2539157