【摘要】：結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種古老而漫長的感染性疾病，由其導致的死亡率居全球第二位，給各國尤其是發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐呢摀�。據世界衛(wèi)生組織(world health organization,WHO)統(tǒng)計，2007年全球新增結核病人937萬，因TB死亡人數(shù)達132萬(不包括HIV陽性患者)。新增病例中亞洲和非洲分別占55%和31%，其中中國以130萬新增病例位居第二位，TB防控形勢非常嚴峻。目前，卡介苗(Bacillus Calmette G uerin，BCG)是唯一一種獲得批準的廣泛使用的TB預防疫苗，對于兒童BCG具有良好的保護效果，但對于成人其保護效果不容樂觀，對于抑制潛伏期結核的復發(fā)更是毫無作用。新發(fā)TB患者主要來源于潛伏MTB感染者，，原因在于休眠狀態(tài)MTB的再激活和復蘇，因此研制新的TB疫苗迫在眉睫。未來的TB疫苗不僅要對剛出生嬰兒以及未感染MTB的人群提供良好的預防作用，對于已感染MTB但尚未發(fā)病的人群也要具有增強細胞免疫、加速清除MTB的保護作用。 1.目的 檢測藤黃微球菌復蘇促生長因子結構域（Resuscitation-promoting factor domain，Rpfd）及其兩個突變體（Rpfd1、Rpfd2）刺激小鼠體內產生特異性抗體及γ干擾素（Interferon γ，IFN-γ）和白細胞介素-2（Interleukin2，IL-2）水平，以評價三種因子的免疫原性。 2.實驗方法和結果 2.1Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白純化、鑒定 將前期制備含谷胱甘肽巰基轉移酶（Glutathione S-transferase， GST）基因片段重組質粒PGEX-4T1-Rpfd、PGEX-4T1-Rpfd1、PGEX-4T1-Rpfd2已轉入E. coliDH5α中的感受態(tài)細胞進行活化、轉接、誘導，獲取表達產物蛋白，將表達產物蛋白進行純化。應用Western-blot方法進行蛋白鑒定，鑒定所表達的蛋白為所需目的蛋白。測定蛋白濃度分別為：Rpfd1.400mg/ml、Rpfd12.438mg/ml、Rpfd23.882mg/ml。 2.2Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導小鼠體內的體液免疫應答 將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強免疫的方法免疫小鼠，測定其在小鼠體內誘導產生的特異性抗體水平。實驗結果表明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白均具有很好的免疫原性，能在小鼠體內產生高效價的抗Rpfd特異性抗體，且三種抗原刺激產生的抗體效價顯著高于BCG免疫組。其中Rpfd2組產生的抗體水平最高，提示其啟動感染宿主體液免疫能力優(yōu)于BCG。使用Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白作為抗原，均能被3種抗體識別，且親合程度趨于一致，說明Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白產生的特異性抗體同Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白之間存在交叉免疫反應，提示該三種蛋白產生的特異性抗體有可能同時封閉MTB的5種Rpf樣蛋白，從而達到抑制休眠MTB復蘇和生長作用。 2.3Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白誘導小鼠體內的細胞免疫應答 將Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白采用同源加強免疫的方法免疫小鼠，測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達水平。用MTB毒株H37Rv攻擊免疫小鼠，測定小鼠外周血中IFN-γ和IL-2表達水平。結果顯示Rpfd、Rpfd1、Rpfd2具有誘導小鼠產生以IFN-γ、IL-2分泌量明顯增加為主的Th1型免疫應答。H37Rv攻擊小鼠后，Rpfd發(fā)揮其促細菌生長作用，使小鼠體內MTB大量生長，巨噬細胞吞噬大量MTB后，崩解死亡導致IFN-γ含量明顯下降；而Rpfd1、Rpfd2無促細菌生長作用，巨噬細胞吞噬MTB后，未達到結核菌負荷過載，巨噬細胞殺滅MTB，同時促進IFN-γ分泌，故IFN-γ量增加。Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白免疫小鼠后，刺激小鼠產生IL-2水平明顯升高，高于BCG免疫組；MTB攻擊免疫小鼠后，三組蛋白免疫組小鼠血清中IL-2檢測量均有下降，Rpfd2蛋白免疫組小鼠血清中IL-2下降尤為明顯，提示IL-2因刺激機體內T淋巴細胞增殖，強化細胞保護性免疫而消耗，Rpfd2組更為明顯。 3結論 Rpfd、Rpfd1、Rpfd2蛋白具有啟動宿主體液免疫功能及增強宿主細胞免疫功能的雙重作用，可通過激發(fā)宿主細胞免疫防御MTB的感染，通過刺激機體產生特異性抗體封閉體內或體外來源的Rpf樣物質、從而抑制體內處于休眠狀態(tài)的MTB的復蘇，可成為預防及治療MTB感染的免疫新策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R52

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王黎霞;成詩明;陳明亭;趙雁林;張慧;姜世聞;何廣學;呂青;杜昕;陳偉;劉小秋;阮云洲;王勝芬;夏aa;于蘭;李峻;李雪;;2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告[J];中國防癆雜志;2012年08期

2 吳雪瓊;;新型結核病疫苗的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J];中國防癆雜志;2012年03期

3 姜麗娜;姚春艷;金齊力;賀文欣;李柏青;;IL-12增強結核病患者中性粒細胞吞噬和殺傷結核桿菌的活性[J];細胞與分子免疫學雜志;2011年11期

4 楊生海;殷宏;劉永生;張杰;;干擾素-γ研究進展[J];生物技術通報;2010年08期

5 姜麗娜;李柏青;姚春艷;金齊力;;Th1型和Th2型細胞因子對人中性粒細胞吞噬結核桿菌活性的影響[J];中華微生物學和免疫學雜志;2010年06期

6 蘇明權;岳喬紅;楊柳;馬越云;劉家云;張建芳;郝曉柯;;5種結核分枝桿菌Rpf樣蛋白的活性鑒定及促生長作用[J];中國人獸共患病學報;2008年09期

7 樊愛琳;簡文;師長宏;蘇明權;柏銀蘭;馬靜;徐志凱;郝曉柯;;藤黃微球菌Rpf結構域多肽誘導小鼠免疫應答的實驗研究[J];細胞與分子免疫學雜志;2008年07期

8 樊愛琳;師長宏;蘇明權;馬靜;柏銀蘭;程曉東;徐志凱;郝曉柯;;抗藤黃微球菌Rpf結構域單克隆抗體的制備與特性鑒定[J];細胞與分子免疫學雜志;2008年05期

9 樊愛琳;蘇明權;師長宏;徐志凱;柏銀蘭;馬靜;劉家云;張建芳;程曉東;郝曉柯;;結核分枝桿菌Rv1009結構域基因的克隆、表達及親和層析純化[J];生物技術通訊;2007年04期

10 黎友倫,羅永艾,王國治;細胞因子及其受體在結核免疫中的作用[J];國外醫(yī)學(內科學分冊);2005年04期

相關博士學位論文 前1條

1 樊愛琳;Rpf蛋白結構域的生物學及免疫學特性的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學;2008年

本文編號：2464629