發(fā)布時間：2018-12-17 04:00

【摘要】：背景 HIV等血源性職業(yè)暴露感染和醫(yī)源性感染是廣大醫(yī)務人員、公安司法干警和公眾最關心的問題之一。傳統(tǒng)的HIV暴露后感染溯源主要依賴于流行病學調查。國外有報道將分子流行病學技術用于HIV暴露后感染溯源調查,通過對可疑傳播鏈上不同個體體內HIV準種群(quasispecies)的基因高可變區(qū)核酸序列進行分析,為HIV職業(yè)暴露感染鑒定、醫(yī)源性感染調查、司法調查等提供分子實驗室依據(jù)。 溯源研究的方法主要有三種,分別是巢式PCR產(chǎn)物直接測序法、巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴增法。巢式PCR產(chǎn)物直接測序法可以獲得優(yōu)勢準種的序列,但弱勢準種序列難以被檢出。而巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴增法則可以同時獲得優(yōu)勢準種和部分弱勢準種,提供更多的準種序列信息用于溯源分析。 本文分別建立了巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴增法兩種基于準種分析的HIV暴露后感染溯源研究方法,并用于調查一起疑似輸血感染HIV案例,為HIV傳播的流行病學調查提供分子實驗室證據(jù),探討了兩種方法的適用性。 目的 1、建立兩種基于準種分析的HIV暴露后感染溯源研究方法,分別是巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴增法； 2、將建立的兩種方法分別用于一起疑似輸血感染HIV案例的溯源分析； 3、探討不同樣品類型(全血、血漿)對單基因擴增法檢測結果有無影響。 材料和方法 1、采集可疑傳播鏈上3例HIV感染者(編號T1-T3)及作為對照的13例已知HIV感染者或艾滋病患者(編號C1-C13)血樣。 2、利用巢式PCR產(chǎn)物克隆法進行溯源研究 先從采集的血漿樣品中提取RNA,然后對RNA進行逆轉錄巢式PCR擴增,挑選擴增成功的產(chǎn)物進行克隆,獲取準種,測序后獲得準種序列,對準種序列進行系統(tǒng)進化樹分析。 3、利用單基因擴增法進行溯源研究 3.1血漿樣品 1)從血漿樣品中提取RNA； 2)將RNA逆轉錄為cDNA; 3)將cDNA進行梯度稀釋,摸索最佳稀釋度； 4)根據(jù)最佳稀釋度進行96孔巢式PCR反應； 5)對擴增成功的孔進行測序,獲得的準種序列進行系統(tǒng)進化樹分析。 3.2全血樣品 1)分別從全血樣品中提取全核酸； 2)將全核酸逆轉錄為cDNA和前病毒DNA； 3)將cDNA和前病毒DNA進行梯度稀釋,摸索最佳稀釋度； 4)以下步驟同血漿樣品。 結果 1、巢式PCR產(chǎn)物克隆法結果 1)在16份樣品中,成功擴增出13份的核酸目的片段。最終獲得59個克隆的核酸序列,大部分克隆間的核酸序列不同。 2)對克隆的核酸序列進行基因離散率分析：大部分樣品內不同克隆間的平均基因離散率小于3%；分析T1與其它樣品間的基因離散率,與T2、T3、C12的基因離散率要小于與對照樣品間的基因離散率。因此提示T1、T2、T3和C12應具有傳播關系。 3)對克隆的核酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析：T1、T2、T3和C12的所有克隆及C13的2個克隆聚為一簇,分支處自展(bootstrap)值為100%；T3部分克隆與T1、T2、C12聚為一簇,T3相對于T1、T2、C12來說應當是并系關系,在分子實驗室方面T3為T1、T2、C12的傳染源。 2、單基因擴增法結果 2.1血漿樣品 1)在16份樣品中,血漿樣品成功擴增出15份的核酸目的片段,獲得153個準種序列,大部分準種間的核酸序列不同。 2)對準種的核酸序列進行基因離散率分析：大部分樣品內不同準種間的平均基因離散率小于4%；分析T1與其它樣品間的基因離散率,與T2、T3、C12的基因離散率要小于與對照樣品間的基因離散率。因此提示T1、T2、T3和C12應具有傳播關系。 3)對準種的核酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析：T1、T2、T3和C12的所有準種聚為一簇,分支處自展(bootstrap)值為94%；T3部分準種與T1、T2、C12聚為一簇,T3相對于T1、T2、C12來說應當是并系關系,在分子實驗室方面T3為T1、T2、C12的傳染源。 4)對照樣品C5與C6進行系統(tǒng)進化樹分析,結合流行病學資料,判定C5為C6的傳染源。 2.2全血樣品 1)在16份樣品中,全血樣品成功擴增出14份的核酸目的片段,獲得153個準種序列,大部分準種間的核酸序列不同。 2)在判定C2與C4的關系時,血漿樣品和全血樣品得到的結果不同,全血樣品獲得的準種可以得到C2為C4的傳染源的分子實驗室證據(jù)而血漿樣品卻無法得到。除此之外,全血樣品與血漿樣品結果一致。 3、兩種方法的比較 兩種方法分別進行HIV暴露后感染溯源研究時分析結果一致。研究結果顯示在亞型分型時,巢式PCR產(chǎn)物克隆法得到的結果在判定對照樣品C8時,僅能判定其為BC亞型,而單基因擴增法可得到C8樣品為07-BC亞型的結果。 結論 1、建立了基于準種分析的兩種HIV暴露后感染溯源檢測方法：巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴增法。 2、將巢式PCR產(chǎn)物克隆法和單基因擴增法分別用于一起疑似輸血感染HIV案例的溯源分析,實驗結果支持HIV從T3經(jīng)T2傳播到T1的流行病學調查線索,顯示分子流行病學技術可以為HIV暴露后感染溯源調查提供更直接的證據(jù)。兩種方法的檢測結果一致。 3、在HIV暴露后感染溯源研究中,單純實驗室檢測數(shù)據(jù)不能判定傳播關系,需與流行病學資料相結合使用。 4、利用單基因擴增法溯源分析時,對于感染時間較長的感染者,使用全血樣品比使用血漿樣品得的準種信息更多。
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【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91

【參考文獻】

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1 焦麗燕;劉永健;郭東星;王錚;耿慶茂;李林;莊道民;鮑作義;劉思揚;李韓平;李敬云;;兩種HIV-1耐藥準種分析方法的比較[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2010年03期

2 梁浩;羅皓;邵一鳴;劉偉;張志勇;邢輝;盧燦健;沈菁;麥志丹;;廣西HIV-1重組毒株env區(qū)快速基因分型方法的建立[J];中華實驗和臨床病毒學雜志;2006年03期

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本文編號：2383616