【摘要】：血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種嚴重危害人類健康、影響社會經(jīng)濟發(fā)展的人畜共患寄生蟲病,在全球76個國家和地區(qū)廣泛流行。長期以來,人們一直在尋找一種能夠有效控制并消滅血吸蟲的方法,但某些地區(qū)的地理環(huán)境或經(jīng)濟條件限制了大規(guī)模滅螺工作或傳染源控制工作的開展,所以就目前而言,藥物治療血吸蟲病的仍將會是控制血吸蟲病的主要手段。目前,全球范圍內(nèi)控制血吸蟲病流行的手段是降低發(fā)病率,化學藥物吡喹酮(praziquantel,PZQ)因其出色的療效和廣泛的適應性被WHO指定為廣譜抗血吸蟲、蠕蟲藥,使其成為抗血吸蟲病藥物的首選。但在吡喹酮長期大范圍使用過程中,日本血吸蟲及曼氏血吸蟲潛在的耐藥性風險也越來越引起人們的重視。因此,作為技術儲備,尋找吡喹酮之后的備選抗血吸蟲病新藥已迫在眉睫。白頭翁(Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel)為多年生草本植物,其干燥根具有清熱解毒、涼血止痢、抗腫瘤、抗炎、抗病原微生物,抗寄生蟲等作用。臨床上常用于阿米巴痢疾、細菌性痢疾和婦科炎癥等疾病的治療。白頭翁總皂苷對日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)蟲卵、毛蚴、尾蚴均有一定的殺滅作用,并且能降低日本血吸蟲糖原和蛋白質(zhì)的含量對其代謝相關酶類也有一定的抑制作用。本課題通過研究白頭翁皂苷提取物的單體Hederacolchiside A(HSA)對體內(nèi)發(fā)育不同階段日本血吸蟲和曼氏血吸蟲(S.mansoni)的作用、對日本血吸蟲成蟲表皮及新陳代謝的影響及對感染日本血吸蟲、曼氏血吸蟲小鼠免疫調(diào)節(jié)的影響,為HSA成為抗血吸蟲新藥提供理論依據(jù)及實驗基礎。實驗首先對感染55±5條日本血吸蟲尾蚴的ICR小鼠在其感染后的1d、7d、14d、21d、28d、35d分別給予不同藥物治療。具體如下,腹腔注射8 mg/kg HSA或6 mg/kg HSA連續(xù)5天;一次口服300 mg/kg PZQ或300 mg/kg青蒿琥酯(artesunate,ART)。于感染后7周檢測不同藥物對不同發(fā)育階段日本血吸蟲的影響。不同劑量的HSA在不同感染時期給藥對體內(nèi)日本血吸蟲均有一定的殺傷作用,在感染后1d、7d給予8 mg/kg HSA治療,日本血吸蟲減蟲率分別為97.2%及92.9%,減雌率分別為94.7%及89.5%,減卵率分別為99.3%及98.7%,效果均優(yōu)于同時期的陽性對照PZQ及ART給藥組。其余時期HSA給藥組的藥效雖不及陽性對照組PZQ或ART,但HSA給藥后小鼠體內(nèi)日本血吸蟲總蟲數(shù)、雌蟲數(shù)及肝臟蟲卵量比未給藥對照組顯著減少。接著對感染45±5條曼氏血吸蟲尾蚴的ICR小鼠在其感染后的1d、7d、21d、42d、49d給予不同藥物治療,具體如下,腹腔注射8 mg/kg HSA連續(xù)5天;一次口服300 mg/kg PZQ或300 mg/kg ART。于感染后8周檢測不同藥物對不同發(fā)育階段曼氏血吸蟲的影響。8 mg/kg HSA在不同感染時期給藥對體內(nèi)曼氏血吸蟲均有一定的殺傷作用,在感染后1d、7d給予8mg/kg HSA治療,曼氏血吸蟲的減蟲率分別為88.6%及80.7%,減雌率分別為92.9%及85.0%,減卵率分別為98.6%及95.3%,效果均優(yōu)于同時期的陽性對照PZQ及ART給藥組。其余時期HSA給藥后小鼠體內(nèi)曼氏血吸蟲總蟲數(shù)、雌蟲數(shù)及肝臟蟲卵量相較于未給藥對照組顯著減少。此實驗結(jié)果表明HSA對體內(nèi)發(fā)育不同階段的日本血吸蟲及曼氏血吸蟲均具有殺傷作用,感染后1d及7d給藥組療效優(yōu)于PZQ及ART,有望成為抗日本血吸蟲及曼氏血吸蟲的候選藥物。為了進一步探討HSA對于血吸蟲病引起的炎癥反應及蟲卵肉芽腫病變有無療效,我們對感染日本血吸蟲或曼氏血吸蟲后不同時期給予HSA、PZQ或ART治療,分別于7或8周檢測小鼠體重、脾重及脾重/體重、小鼠體內(nèi)的免疫球蛋白(Ig G)及細胞因子(tumor necrosis factor(TNF)-α、interleukin(IL)-4、IL-17a)的表達水平、小鼠肝臟蟲卵肉芽腫形態(tài)及大小和對小鼠肝臟早期纖維化的影響。結(jié)果顯示,在日本血吸蟲感染21d前給予不同劑量HSA治療能明顯提高小鼠的體重,顯著下調(diào)小鼠的脾重/體重,并能明顯降低TNF-α及IL-17a表達水平。日本血吸蟲感染后35d前給予低劑量HSA治療,均能明顯下調(diào)IL-4的表達,并且在其感染日本血吸蟲的7d、14d、21d低劑量給藥組小鼠免疫球蛋白Ig G表達下調(diào)明顯。HSA能顯著提高曼氏血吸蟲感染49d前小鼠的體重,顯著下調(diào)小鼠的脾重/體重。曼氏血吸蟲感染21d前給予HSA治療能明顯降低IL-4的表達,在感染后1d、7d、21d、42d給予HSA治療能明顯下調(diào)TNF-α的表達,在感染后1d、7d、21d、49d給予HSA治療能明顯抑制IL-17a的表達,但在曼氏血吸蟲感染后期的42d及49d對小鼠進行HSA治療,才能明顯降低免疫球蛋白Ig G表達。曼氏血吸蟲感染與日本血吸蟲感染后HSA給藥組小鼠情況類似,在早期給予HSA治療對于肉芽腫的治療效果明顯,隨著兩種血吸蟲發(fā)育的進程,給藥時間越晚小鼠肝臟病變程度越嚴重。給予不同劑量HSA治療,均能顯著的降低所有感染階段小鼠肝臟蟲卵肉芽腫的平均直徑。感染日本血吸蟲或曼氏血吸蟲7d前給予HSA治療小鼠肝臟細胞排列規(guī)則,形態(tài)正常,極少有蟲卵沉積,淋巴細胞侵潤現(xiàn)象極不明顯,形態(tài)上與正常肝臟組織極為相似。并且在感染7d前給予HSA治療小鼠肝臟中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、金屬蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)、Ⅰ型膠原(collagen TypeⅠ)極少量表達。綜合上述結(jié)果我們發(fā)現(xiàn),在感染日本血吸蟲或曼氏血吸蟲早期給予HSA治療,感染7-8周后能顯著下調(diào)小鼠的免疫反應,減少肝臟肉芽腫的形成,提示了HSA有希望成為預防及輔助治療血吸蟲病藥物。最后檢測HSA對體外培養(yǎng)日本血吸蟲成蟲的作用,利用掃描電子顯微鏡進行掃描觀察血吸蟲表皮的形態(tài)變化,并感染日本血吸蟲42d利用8 mg/kg HSA腹腔注射24h后檢測蟲體的糖原(glycogen),蛋白(protein),酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP),堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的變化,來初步探討HSA對日本血吸蟲的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)蟲體對藥物的敏感性呈濃度依賴及時間依賴性,HSA對成蟲的100%致死濃度12h為0.5μg/ml。陽性對照PZQ組12h成蟲100%致死濃度則需要30μg/ml。HSA在相同的作用時間成蟲100%致死濃度比陽性對照組更低。HSA孵育4h的日本血吸蟲雌、雄蟲體表海綿樣結(jié)構(gòu)排列混亂,皮層褶脊腫脹融合形成裂痕,感覺乳突上的纖毛消失,感覺乳突塌陷,部分表皮潰爛皮下組織暴露。并且在HSA對用下,日本血吸蟲體內(nèi)糖原、蛋白、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶及超氧化物歧化酶比未經(jīng)處理的對照組顯著下調(diào)。這些實驗結(jié)果說明HSA作用于日本血吸蟲可能對其新陳代謝及抗氧化能力有一定的影響,進而通過宿主的免疫防御,最終殺滅蟲體。
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【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R532.21

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本文編號：2366560