【摘要】：目的原核表達(dá)的剛地弓形蟲(chóng)致密顆粒蛋白5(rGRA5)免疫診斷價(jià)值的探討。方法 GRA5基因在RTPCR被擴(kuò)增,構(gòu)建pET28a-GRA5原核表達(dá)載體,雙核酸內(nèi)酶切及序列測(cè)定進(jìn)行鑒定,pET28a-GRA5IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE和Western blot法檢測(cè)該重組蛋白的表達(dá)。建立以純化的重組蛋白的間接ELISA法,檢測(cè)收集樣本血清中弓形蟲(chóng)特異性抗體。結(jié)果 PCR反應(yīng)擴(kuò)增出為363 bp大小的GRA5基因,所構(gòu)建的pET28a-GRA5原核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切顯示插入片段大小與上相符,DNA測(cè)序結(jié)果表明與Gen Bank中錄入的GRA5基因經(jīng)Blast比對(duì)序列同源性100%,原核細(xì)胞表達(dá)的該重組蛋白在SDS-PAGE和Western blot中均有顯示(約14 ku)。本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA法檢測(cè)的100例弓形蟲(chóng)感染者(血清學(xué)陽(yáng)性)血清中有73例呈陽(yáng)性,陽(yáng)性率為73.0%(73/100),其中40例IgG陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性率為72.5%(29/40),30例IgM陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性率為53.3%(16/30),30例IgG、IgM均陽(yáng)性標(biāo)本的陽(yáng)性率為93.3%(28/30),30例陰性血清標(biāo)本的陽(yáng)性率僅為6.7%(2/30)。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)獲得的原核表達(dá)的rGRA5具有一定的弓形蟲(chóng)病免疫診斷的潛在價(jià)值。
[Abstract]:Objective to investigate the immunological diagnostic value of dense granule protein 5 (rGRA5) of Toxoplasma gondii expressed in prokaryotes. Methods the GRA5 gene was amplified by RTPCR, and the prokaryotic expression vector of pET28a-GRA5 was constructed. The expression of the recombinant protein was detected by SDS-PAGE and Western blot methods after the expression of the recombinant protein was identified by endonuclease digestion and sequencing. After the expression was induced by pET28a-GRA5IPTG, the expression of the recombinant protein was detected by SDS-PAGE and Western blot methods. An indirect ELISA assay was established to detect Toxoplasma gondii specific antibodies in serum of purified recombinant proteins. Results the GRA5 gene with the size of 363 bp was amplified by PCR reaction, and the pET28a-GRA5 prokaryotic expression vector was constructed by double enzyme digestion. The DNA sequencing results showed that the length of the inserted GRA5 gene was 100 homology with the GRA5 gene entered in Gen Bank by Blast comparison. The recombinant protein expressed by prokaryotic cells was displayed in both SDS-PAGE and Western blot (about 14 ku). Of the 100 cases of Toxoplasma gondii infection (seropositive) detected by ELISA method, 73 cases were positive, the positive rate was 73.0% (73 / 100), and the positive rate of 40 IgG positive specimens was 72.5% (29 / 40). The positive rate of 30 IgM positive specimens was 53.3% (16 / 30), the positive rate of 30 IgG,IgM positive samples was 93.3% (28 / 30), and the positive rate of 30 negative serum samples was only 6.7% (2 / 30). Conclusion the prokaryotic expression of rGRA5 obtained in this study has a potential value in immunological diagnosis of toxoplasmosis.
【作者單位】： 安徽醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)教研室;太和縣中醫(yī)院檢驗(yàn)科;
【基金】：安徽省高校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(編號(hào):KJ2016A353)
【分類號(hào)】：R531.8

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