【摘要】：白細胞分化抗原14(cluster of differentiation antigen14, CD14)是參與脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)誘導炎癥細胞因子釋放的重要分子之一,它也是布魯氏菌細胞壁主要成分LPS的受體。microRNA(miRNA)是一類非編碼的RNA,它參與到生命活動的許多進程中,如細胞增殖、凋亡、病毒防御和細菌感染等。研究表明：CD14基因沉默可以有效抑制LPS刺激條件下腫瘤壞死因子a(TNF-a)、趨化因子配體2(MIP-2)、白細胞介素-6(IL-6)和一氧化氮(NO)的產生。 該研究以本課題組雷明等人構建的mCD14knockdown RAW264.7(224.3)細胞為基礎,運用miRNA基因芯片和qRT-PCR技術分析CD14沉默條件下miRNAs的差異表達；利用B.melitensis M5-90LPS刺激224.3細胞,分析B.melitensis M5-90LPS對miRNAs的影響；利用生物信息學軟件和Gene Ontology對差異表達miRNAs的潛在靶基因進行預測并分類；利用qRT-PCR. Western blot和雙熒光素酶報告基因技術,對B.melitensis M5-90感染224.3細胞后差異變化miR-199a-3p調控靶基因的作用機制進行初步研究。 結果表明：與對照細胞相比,在224.3細胞中,mmu-miR-199a-3p、 mmu-miR-199a-5p和mmu-miR-21-5p表達上調；在B.melitensisM5-90LPS刺激224.3細胞后發(fā)現(xiàn),mmu-miR-199a-3p和mmu-miR-199a-5p表達上調,但與未刺激實驗結果相比,mmu-miR-199a-3p的上調水平明顯降低；利用四個在線數(shù)據(jù)庫對差異表達miRNAs的靶基因進行生物學預測,并通過Gene Ontology對靶基因進行分類；在B.melitensis M5-90感染224.3細胞后,Cbl-b基因表達下調,在mRNA水平和蛋白水平的驗證結果一致；通過熒光素酶實驗我們發(fā)現(xiàn),構建含有靶位點的熒光素酶載體與miR-199a-3p模擬物共同轉染靶細胞,可以顯著抑制螢火蟲熒光素酶活性,這些結果初步證實了在B.melitensis M5-90感染224.3細胞內,miR-199a-3p可以靶向調控Cbl-b的表達。這些結論為研究通過抑制上游炎癥通路以減弱損傷性炎癥反應的作用機理提供了重要信息,同時為探索布魯氏菌病致病機理提供了重要的理論依據(jù)。
[Abstract]:Leukocyte differentiation antigen (14 (cluster of differentiation antigen14, CD14) is one of the important molecules involved in the release of inflammatory cytokines induced by lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS). It is also the receptor. MicroRNA (miRNA) of LPS, the main component of Brucella cell wall, which is a kind of non-coding RNA,. It is involved in many life processes, such as cell proliferation, apoptosis, virus defense and bacterial infection. CD14 gene silencing can effectively inhibit the production of tumor necrosis factor a (TNF-a), chemokine ligand 2 (MIP-2), interleukin-6 (IL-6) and nitric oxide (NO) (NO) stimulated by LPS. On the basis of mCD14knockdown RAW264.7 (224.3) cells constructed by Lei Ming et al., the differential expression of miRNAs under CD14 silencing condition was analyzed by miRNA gene chip and qRT-PCR technique. Using B.melitensis M5-90LPS to stimulate 224.3 cells to analyze the effect of B.melitensis M5-90LPS on miRNAs; using bioinformatics software and Gene Ontology to predict and classify the potential target genes for differentially expressed miRNAs; and using qRT-PCR. Western blot and double luciferase reporter gene technique were used to study the mechanism of differential change of miR-199a-3p regulatory target gene in 224.3 cells infected with B.melitensis M5-90. The results showed that the expression of mmu-miR-199a-3p, mmu-miR-199a-5p and mmu-miR-21-5p was up-regulated in 224.3 cells compared with control cells. The expression of mmu-miR-199a-3p and mmu-miR-199a-5p was up-regulated in 224.3 cells stimulated by B.melitensisM5-90LPS, but the up-regulation level of mmu-miR-199a-3p was significantly lower than that of unstimulated cells. The target genes of differentially expressed miRNAs were predicted by four online databases, and the target genes were classified by Gene Ontology. After B.melitensis M5-90 was infected with 224.3 cells, the expression of Cbl-b gene was down-regulated, and the results were consistent at the level of mRNA and protein. Through luciferase experiment, we found that the construction of luciferase vector containing target sites and miR-199a-3p mimics can significantly inhibit the luciferase activity of firefly. These results suggest that miR-199a-3p can target the expression of Cbl-b in 224.3 cells infected with B.melitensis M5-90. These conclusions provide important information for the study of the mechanism of inhibiting the upstream inflammatory pathway and provide important theoretical basis for exploring the pathogenetic mechanism of brucellosis.
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R516.7

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本文編號：2310875