【摘要】：研究目的 乙型重型肝炎病死率高,預(yù)后差。尋找可用于早期預(yù)示和早期診斷重型肝炎發(fā)生的分子標(biāo)志物是目前病毒性肝炎研究的熱點(diǎn)之一。越來(lái)越多的證據(jù)表明循環(huán)microRNAs (cir-miRNAs)可能作為潛在的疾病診斷生物標(biāo)志物。本課題旨在研究乙型肝炎重癥化過(guò)程中血清1miRNA表達(dá)譜的變化以篩選差異表達(dá)的microRNA-210(miRNA-210).評(píng)價(jià)血清miR-210水平與乙型肝炎重癥化進(jìn)程的關(guān)聯(lián)關(guān)系、探討miR-210在乙型肝炎重癥化過(guò)程中的潛在功能及其作用機(jī)制,為乙型肝炎重癥化的早期預(yù)測(cè)、預(yù)防和治療提供新型靶標(biāo)。 研究方法 1miRNA芯片實(shí)驗(yàn) (1) miRNA表達(dá)譜分析： 用TaqMan(?) Human MicroRNA Array A分析健康人混合血清樣本(10例等體積混合)、慢乙肝輕度病人混合血清樣本(10例等體積混合)、乙型慢加急肝衰竭病人混合血清樣本(10例等體積混合)的miRNAs表達(dá)譜。 (2)篩選差異表達(dá)]miRNAs: 以(Ct35)且(|△△Ct|≥2)為判定標(biāo)準(zhǔn),初步篩選可擴(kuò)增檢測(cè)到的差異表達(dá)的1miRNAs。 (3)候選miR-210的選擇：以(Ct35)且(△△Ct≤-2)為判定標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)一步篩選隨著乙型肝炎病情嚴(yán) 重程度表達(dá)水平升高的miR-210用于單樣本RT-qPCR驗(yàn)證。 2人群調(diào)查 (1)血清樣本：30例慢乙肝輕度病人血清、30例慢乙肝重度病人血清、30例乙型慢加急肝 衰竭病人血清及30例健康對(duì)照血清。 (2)miR-210的再驗(yàn)證：針對(duì)miRNA芯片篩選出來(lái)的差異表達(dá)的miR-210進(jìn)行單樣本RT-qPCR驗(yàn)證。 (3)其他檢測(cè)指標(biāo)：肝功能(ALT、AST、TBIL、PTA),血清HBV標(biāo)記物,病毒載量。 3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)小鼠尾靜脈注射Con A (20mg/kg)制備小鼠急性肝衰竭模型，并于注射后 6、12、24小時(shí)處死動(dòng)物,收集外周血和肝組織,檢測(cè)下列指標(biāo)： (1)缺氧探針染色：檢測(cè)缺氧肝細(xì)胞。 (2)熒光定量PCR：檢測(cè)肝組織和血清miR-210水平。 (3)熒光定量PCR：檢測(cè)小鼠肝組織miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA水平。 4.體外實(shí)驗(yàn) HepG2.2.15細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空白對(duì)照(DEPC水)、模擬物陰性對(duì)照和miR-210模擬物后,缺氧培養(yǎng)24h或48h后檢測(cè)下列指標(biāo)： (1) CCK8assay:檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞線粒體脫氫酶活性。 (2)病毒學(xué)指標(biāo)檢測(cè)：培養(yǎng)基上清HBsAg、HBeAg、HBV DNA拷貝數(shù)；HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)HBsAg mRNA水平。 研究結(jié)果 1miRNA芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)血清中可檢測(cè)到miRNA的數(shù)量和表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著增加。 (2)乙型肝炎病人血清let-7b等20個(gè)miRNAs表達(dá)水平顯著高于健康對(duì)照組。 (3)血清中miR-210、miR-324-5p、miR-423-5p表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著升高。 2人群調(diào)查結(jié)果 (1)輕/重度乙型肝炎和乙型慢加急肝衰竭病人血清中miR-210的水平顯著高于健康對(duì)照組(P0.05),血清中miR-210表達(dá)水平隨著乙型肝炎病情進(jìn)展顯著性升高。 (2)慢性乙型肝炎患者血清miR-210水平與ALT/AST水平及血清總膽紅素水平呈正相關(guān)(P0.05),與凝血酶原活動(dòng)度呈負(fù)相關(guān)(P0.05)。 3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)小鼠肝衰竭進(jìn)程存在動(dòng)態(tài)缺氧現(xiàn)象。Con A暴露6h組和12h組小鼠肝細(xì)胞缺氧率顯著性增加(P0.05),Con A暴露24h組小鼠肝細(xì)胞缺氧率顯著高于Oh組(P0.05),但低于6h和12h組(P0.05)。 (2)小鼠肝組織和血清miR-210表達(dá)水平隨著病情進(jìn)展顯著升高。 (3)小鼠肝衰竭進(jìn)程miR-210靶基因Iscu、Ndufa4、Sdhd、Gpd11和Cox10mRNA表達(dá)水平顯著性減少(P0.05)。 4細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (1)缺氧條件下miR-210過(guò)表達(dá)抑制HepG2.2.15細(xì)胞線粒體脫氫酶活性。 (2)缺氧條件下miR-210過(guò)表達(dá)抑制HBV DNA復(fù)制和HBsAg表達(dá)。 研究結(jié)論 1.miRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示：乙型肝炎重癥化進(jìn)程血清中miRNA的數(shù)量和表達(dá)水平與乙型肝炎病情嚴(yán)重程度有關(guān)。 2.肝炎病人調(diào)查顯示：miR-210對(duì)乙型肝炎重癥化進(jìn)程有重要的提示作用,miR-210對(duì)乙型肝炎重癥化的早期診斷有重要意義。 3.肝炎病人miR-210表達(dá)水平升高的內(nèi)在機(jī)制是炎癥導(dǎo)致肝細(xì)胞缺氧,進(jìn)而誘導(dǎo)miR-210表達(dá)。 4.通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體代謝,miR-210在乙型肝炎重癥化進(jìn)程中可能起著重要的保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R512.62

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本文編號(hào)：2302726