【摘要】：自從1981年首次發(fā)現(xiàn)艾滋病患者以來，艾滋病在全球范圍迅速傳播，已經(jīng)嚴重威脅人類的健康，，對社會造成巨大的破壞。艾滋病是由人類免疫缺陷病毒（HIV-1）引起，病毒復制周期中特異性的活性位點和關鍵酶為抗病毒化學治療提供了潛在的靶標。其中，HIV-1編碼的整合酶（IN）將HIV-1反轉錄后的產(chǎn)物cDNA整合入宿主基因組，它是病毒復制過程中不可缺少的酶。由于人類宿主的正常細胞中并不存在IN的功能類似物，使得特異性作用于IN的抑制劑對于正常細胞毒性較小；同時，IN采用單一的活性位點去適應兩種不同的DNA底物，這在一定程度上限制了HIV-1產(chǎn)生對IN抑制劑的耐藥株，因此是研發(fā)抗HIV-1藥物的一個非常有意義的靶點。 在體內(nèi)，整合作用是一個多步驟的反應過程，主要包括：病毒cDNA與IN結合；IN發(fā)揮內(nèi)切酶作用對病毒cDNA進行3'-加工；IN通過鏈轉移反應將病毒cDNA整合到宿主細胞DNA。在體外，使用重組IN蛋白、寡聚核苷酸DNA底物以及二價金屬離子可以實現(xiàn)IN在體內(nèi)所發(fā)揮的整合功能，據(jù)此建立高效的IN抑制劑的篩選方法，是當前IN抑制劑體外篩選的主要手段。本研究表達純化了重組IN蛋白，建立了高通量的HIV-1整合酶抑制劑篩選方法。與原有方法相比，本研究新建立的篩選方法靈敏可靠、步驟簡便、成本低廉。 藥物篩選不僅包括生物實驗方法，計算機輔助虛擬篩選方法在藥物篩選中也占據(jù)了越來越重要的地位。本論文不僅在生物學實驗基礎上進行了整合酶抑制劑篩選方法的探索，還從計算機模擬和機器學習的角度對整合酶抑制劑虛擬篩選進行了研究。利用CoMFA分析以及支持向量機（SVM）建模等方法考察HIV-1整合酶抑制劑活性，建立了基于定量構效關系（QSAR）和SVM的預測模型，通過預測結果來判斷模型的外部預測能力，結果顯示SVM表現(xiàn)出了較強的建模和預測能力。 論文工作主要包括以下三個方面： （1）表達純化整合酶蛋白并進行鏈轉移反應活性鑒定 首先將HIV-1整合酶原核表達載體pET-28a（+）/IN（F185K/C280S）轉化入大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21（DE3）進行原核表達，該表達載體含有IN基因并引入了F185K/C280S突變以提高蛋白溶解性。用鎳瓊脂糖凝膠進行親和層析純化，獲得了純度和活性均較高的整合酶重組蛋白。運用高通量的酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA），對重組蛋白進行鏈轉移活性鑒定，表明重組蛋白具有較好的催化活性，該工作為建立整合酶鏈轉移反應抑制劑篩選方法奠定了基礎。 （2）建立便捷高效的整合酶鏈轉移反應抑制劑篩選方法 研究的目標是建立高效便捷的HIV-1整合酶鏈轉移反應抑制劑篩選方法，設計了生物素標記的供體DNA和熒光基團FITC標記的靶DNA，用鏈霉親和素磁珠捕獲反應體系中的DNA產(chǎn)物；最后用熒光分析儀檢測DNA產(chǎn)物的熒光信號，并計算待測樣品的抑制率。用已知整合酶抑制劑S-1360和MK-0518對篩選方法進行了驗證，測定結果與已有實驗數(shù)據(jù)相符合，表明本篩選方法能夠有效并可靠地應用于HIV-1整合酶鏈轉移反應抑制劑的篩選。 與原有的整合酶鏈轉移反應抑制劑篩選方法相比，本篩選方法還具有顯著的改進：(i)原有的HIV-1整合酶鏈轉移反應抑制劑體外篩選方法是用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體檢測地高辛基團，并利用堿性磷酸酶的特異性顯色反應來讀取信號，而本方法是利用熒光基團標記靶DNA，直接檢測熒光基團的熒光信號即可對整合酶的鏈轉移反應活性或待測樣品的抑制活性進行評價，故本方法步驟更為簡單，省力省時；(ii)原有的方法需要使用堿性磷酸酶標記的抗地高辛抗體，而本方法無需使用抗地高辛抗體，成本更為低廉。 該方法還能應用于去整合反應和抑制劑作用機理的研究，具有重要的學術和應用價值。 （3）應用CoMFA和SVM構建嘧啶酮類HIV-1整合酶抑制劑篩選模型 SVM應用于抑制劑篩選，通過對抑制劑進行定量構效關系（QSAR）建模，將化合物的活性與化合物的各種結構參數(shù)建立起相關聯(lián)系，確定回歸方程以預測新化合物的活性。應用CoMFA軟件計算68個嘧啶酮類（pyrimidones）化合物的拓撲、分子極化、親水性等結構參數(shù)，用所選的結構參數(shù)作為SVM的輸入，建立起非線性的支持向量回歸模型。模型獲得訓練集的活性預測值與實驗值相關系數(shù)為0.938，獲得測試集的活性預測值與實驗值相關系數(shù)為0.804，表明模型所獲得的活性預測值與實驗結果相吻合，說明模型能夠有效地進行HIV-1IN抑制劑篩選。 本研究利用SVM算法與CoMFA方法相結合，為建立抑制劑篩選模型提供了一些有益的探索和有價值的信息，不僅可以進行藥物虛擬篩選，并且可以為抗HIV-1藥物設計提供有效的生物學信息。
[Abstract]:Since the discovery of AIDS patients for the first time in 1981, the rapid spread of AIDS worldwide has seriously threatened the health of mankind and has caused enormous damage to society. AIDS is caused by human immunodeficiency virus (HIV-1), and specific active sites and critical enzymes in viral replication cycles provide potential targets for antiviral chemotherapy. in which HIV-1-encoded integrase (IN) binds HIV-1 back-transcribed product cDNA into the host genome, which is an indispensable enzyme in the viral replication process. Since the functional analogue of IN is not present in the normal cells of the human host, the inhibitor specifically acting on IN is less toxic to normal cells, and in the meantime, the IN employs a single active site to accommodate two different DNA substrates, This, to some extent, limits HIV-1-induced resistance to the IN inhibitor and is therefore a very meaningful target for the development of anti-HIV-1 drugs. In vivo, the whole action is a multi-step reaction process, which mainly includes the combination of virus cDNA and IN, 3 '-processing; IN binds the virus cDNA to the host cell D by chain transfer reaction NA. In vitro, using recombinant IN protein, oligo-DNA substrate and divalent metal ion can realize the whole function of IN in vivo, thereby establishing a screening method of an effective IN inhibitor, which is the main screening method of the IN inhibitor in vitro. The recombinant IN protein was purified by this study, and the high-throughput screening of HIV-1 integrase inhibitor was established. Compared with the original method, the new screening method is sensitive and reliable, Low cost. The drug screening not only includes the biological experiment method, but also the computer-aided virtual screening method also occupies more and more in drug screening. This paper not only carries on the exploration of the screening method of the whole enzyme inhibitor on the basis of biology experiment, but also the virtual screening of the whole enzyme inhibitor from the angle of computer simulation and machine learning. The activity of HIV-1 integrase inhibitor was investigated by means of CoMFA analysis and support vector machine (SVM) modeling, and a prediction model based on quantitative structure effect relation (QSAR) and SVM was established. The results show that SVM shows strong modeling and prediction capability. The work of the thesis mainly comprises the following three aspects: (1) expression and purification of the whole enzyme protein and carrying out the activity identification of chain transfer reaction, firstly, transforming the prokaryotic expression vector of HIV-1 into the prokaryotic expression vector of the whole enzyme of HIV-1 (+)/ IN (F185K/ C280S) into E. coli JM109 cell B, L21 (DE3) was expressed in the prokaryotic expression vector, which contained IN gene and introduced F185K/ C. 280S mutation to improve protein solubility. Purification by affinity chromatography with nickel agarose gel to obtain purity and carrying out chain transfer activity identification on the recombinant protein by using a high-flux enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), The method lays a foundation for the screening method of the reaction inhibitor. The aim of this study is to establish an efficient and convenient screening method for the enzyme transfer inhibitor of HIV-1 integrase chain transfer. The target DNA labeled with FITC-labeled body DNA and fluorescent group is used to capture the DNA product in the reaction system by streptavidin magnetic beads; and finally, the DN is detected by a fluorescence analyzer. The fluorescence signal of A product is calculated and the inhibition rate of the sample to be measured is calculated. The screening method is verified by using the known whole enzyme inhibitor S-1360 and MK-0518, and the measurement result is consistent with the existing experimental data, so that the screening method can be effectively and reliably applied. Compared with the screening method of the original whole enzyme chain transfer reaction inhibitor, the screening method has the remarkable improvement: (i) the original HIV-1 integrase chain transfer reaction inhibitor in vitro screening method The method is characterized by that a fluorescent group is used to mark the target DNA, the fluorescent signal of the fluorescent group can be directly detected, The chain transfer reaction activity of the enzyme or the inhibition activity of the sample to be measured is evaluated, so that the method is simpler and labor-saving, The method does not need to use the anti-goxin antibody, and the cost is lower. The method can also be applied to the de-integration. The research on the mechanism of reaction and inhibitor action has important academic and application values. CoMFA and SVM are used to construct a screening model SVM for the anti-HIV-1 integrase inhibitor, which is applied to inhibitor screening, and the quantitative structure effect relationship (Q) is carried out on the inhibitor. SAR modeling to combine the activity of the compounds A regression equation is established to predict the activity of a new compound by establishing a regression equation to predict the activity of the new compound, and the structure parameters such as the topology, molecular polarization, hydrophilicity and the like of 68 oxycodone compounds are calculated by the CoMFA software, Using the selected structural parameters as the input of the SVM, a nonlinear support vector regression model was established. The correlation coefficient between the activity predicted value and the experimental value of the training set was 0.9938, and the correlation coefficient of the activity predicted value and the experimental value of the test set was 0. 804, indicating the predicted activity predicted value of the model. This study uses SVM and CoMFA to provide some useful exploration and valuable information to establish the inhibitor screening model, which not only can
【學位授予單位】：北京工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91;R446.1

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本文編號：2278780