本文選題：蛋白酶體輔助因子 + 分枝桿菌��； 參考：《西南大學》2014年碩士論文

【摘要】：結核病是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,簡稱結核菌)引起的全球性感染性疾病。據世界衛(wèi)生組織報告,全球三分之一的人感染過結核菌,而僅在2012年結核病患者就有860萬,全球結核病死亡人數高達130萬。結核病疫情如此嚴重,除了其致病菌結核菌的獨特致病特性外,多重耐藥結核(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結核(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB)的出現以及和結核菌與人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)共感染,使得結核病疫情更加難以控制。 目前治療結核病的一線藥物包括異煙肼(Isoniazid, INH).利福平(Rifampicin, RIF)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide, PZA)以及乙胺丁醇(Ethambutol, EMB)對MDR-TB和XDR-TB患者無效。因此二線抗結核藥物氨基糖苷類抗生素、多肽類抗生素和氟喹諾酮類抗生素作為MDR-TB和XDR-TB患者的主要藥物。其中氟喹諾酮藥物因具備低毒副作用和大量的衍生物的特點而倍受重視。然而,針對氟喹諾酮藥物的耐藥菌的不斷出現使得結核病防控雪上加霜。 因此,我們試圖尋找分枝桿菌耐氟喹諾酮藥物的新機制,將相關基因作為潛在的氟喹諾酮藥物增效劑靶點,為解決MDR-TB和XDR-TB的藥物開發(fā)提供基礎。本實驗之前的工作初篩到了一株對莫西沙星超敏感的恥垢分枝桿菌(Mycobacteirum smegmatis)突變株M371,并鑒定了轉座子插入的位點。本課題將進一步驗證突變株M371超敏感的表型及其機制,并初步探索突變株在脅迫反應中的作用。 首先,采用8倍野生型恥垢分枝桿菌最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)的莫西沙星處理恥垢分枝桿菌野生型和突變株M371,記錄處理不同時間后的菌落形成單位(colony-forming unit,CFU),計算存活率并作殺菌曲線,驗證突變株M371的莫西沙星超敏感表型。然后,為了研究基因MSMEG_3888在恥垢分枝桿菌在天然耐受(intrinsic resistance)莫西沙星中的作用,構建突變株M371的回補菌株。而MSMEG_3888結核菌H37Rv中的對應基因為Rv2095c。將基因Rv2095c克隆并連接到穿梭質粒pALACE上,并將重組質粒pALACE-Rv2095c電轉化入突變株M371,獲得回補菌株。并采用Western-blot檢測回補菌株中基因Rv2095c的表達和MIC實驗判斷對莫西沙星的敏感性。最后,探索突變株M371、野生株和回補菌株在表面性質方面的差異,并以過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)及十二烷基磺酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfonate, SDS)模擬肺泡的環(huán)境來研究三株菌的脅迫反應。 實驗結果表明：恥垢分枝桿菌突變株M371的經莫西沙星處理存活率比野生型低,為莫西沙星超敏感表型。通過菌液PCR驗證和基因測序,證明了成功構建了回補菌株M371-pALACE-Rv2095c。Western-blot驗證了Rv2095c異源表達成功,并且回補菌株與野生型具有相同的耐受能力。由此證明了基因MSMEG_3888參與對莫西沙星的本底耐受。在生物表面性質方面,恥垢分枝桿菌野生型、突變株M371和回補菌株,三者在單菌落形態(tài)和滑動能力方面無明顯差異；但在脂質系數方面差異明顯,突變株較野生型明顯下降。三者在SDS耐受水平無顯著差異,突變株較野生株在雙氧水耐受水平亦無明顯差異。三株菌在脅迫應答中無明顯差異。 因此,本研究證明了基因MSMEG_3888的參與天然耐受,基因MSMEG_3888并不影響恥垢分枝桿菌的表面性質,亦不參與脅迫應答。
[Abstract]:Tuberculosis is a global infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis . According to the World Health Organization , one - third of the world ' s people have been infected with tuberculosis , but only in 2012 there were 8.6 million TB patients . The number of tuberculosis deaths in the world was 1.3 million . The presence of multi - drug resistant tuberculosis ( MDR - TB ) and broad - resistant tuberculosis ( XDR - TB ) , and tuberculosis and human immunodeficiency virus ( HIV ) , were more difficult to control , in addition to their unique pathogenic characteristics .

Currently , first - line drugs for tuberculosis include Isophthalazide ( INH ) . Rifampicin , rif , pyrazinamide ( PZA ) and ethambutol ( emb ) are ineffective for MDR - TB and XDR - TB patients . Therefore , two - line anti - tuberculosis drugs , such as aminoglycosides , polypeptide antibiotics and fluoroquinolone antibiotics , are important drugs for MDR - TB and XDR - TB patients .

Therefore , we try to find a new mechanism of fluoroquinolone drug for Mycobacterium tuberculosis , which will provide the basis for the drug development of MDR - TB and XDR - TB .

The mutant M371 was cloned and ligated into the shuttle plasmid pALACE . The results showed that the mutation strain M371 was cloned and ligated into the shuttle plasmid pALACE , and then the recombinant plasmid pALACE - Rv95c was transformed into the shuttle plasmid pALACE .

The results showed that the survival rate of M371 of Mycobacterium smegmatis mutant strain M371 was lower than that of wild type , which was more sensitive than wild type .
However , there was no significant difference between mutant strain and wild - type strain at SDS - tolerance level . There was no significant difference in the tolerance level between mutant strain and wild strain . There was no significant difference in the stress response .

Therefore , the study demonstrated that the gene MSV3888 was not involved in the surface properties of Mycobacterium smegmatis , nor was it involved in the stress response .
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R52

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本文編號：1967032