本文選題：細粒棘球絳蟲 + 原頭節(jié)�。� 參考：《中國疾病預防控制中心》2014年博士論文

【摘要】：包蟲病,是由棘球蚴寄生于人體及多種動物體內(nèi)所致的一種嚴重的人獸共患寄生蟲疾病。該病嚴重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展,目前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。在我國以細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus, E. granulosus)感染引起的囊性包蟲病為主,至今仍未得到有效控制。對蟲體免疫逃避機制以及生理適應(yīng)性認識不足制約了細粒棘球蚴疫苗及藥物的設(shè)計與開發(fā)。細粒棘球絳蟲的幼蟲階段即原頭節(jié),不僅能夠在終末宿主的小腸中發(fā)育成成蟲,而且可以在中間宿主體內(nèi)發(fā)育成單室性包囊(即“雙向發(fā)育”能力)。此外,它能夠感染、適應(yīng)多種哺乳動物宿主。這些特點讓原頭節(jié)成為寄生蟲-宿主相互作用研究的重要模型。本課題從宿主-病原相互作用關(guān)系入手,探索細粒棘球絳蟲原頭節(jié)感染對小鼠免疫系統(tǒng)的作用,尤其關(guān)注免疫細胞前體細胞——髓源抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)在感染前后差異表達基因?qū)ζ涔δ艿恼{(diào)控；同時利用轉(zhuǎn)錄組測序以及生物信息學技術(shù),分析原頭節(jié)排泄分泌蛋白整體功能特征。研究結(jié)果將深化細粒棘球絳蟲免疫逃避機制及其生理適應(yīng)性認識,為進一步開展包蟲病新型疫苗的設(shè)計及優(yōu)化、藥物靶標的篩選提供重要分子基礎(chǔ)。第一部分細粒棘球絳蟲原頭節(jié)感染小鼠免疫細胞表型及功能宿主免疫系統(tǒng)的功能、狀態(tài)是宿主抵抗寄生蟲的關(guān)鍵,而免疫逃避是寄生蟲在宿主體內(nèi)生存的必要條件。前人研究表明E. granulosus原頭節(jié)感染可顯著下調(diào)或抑制宿主免疫應(yīng)答,是其免疫逃避的重要因素,但究竟是怎樣的調(diào)節(jié)機制至今尚不明確。本研究從整體水平研究E. granulosus原頭節(jié)感染對宿主執(zhí)行固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答細胞功能的影響,探索其可能的免疫逃避機制。從病羊肝臟(或肺臟)包囊中收集原頭節(jié),分子鑒定為G1型,腹腔注射感染Balb/c小鼠,2000條/只,建立細粒棘球蚴病小鼠模型。同時設(shè)立生理鹽水對照組。在感染后不同時間點(30,180,360 d)采集小鼠外周血和脾臟,制備單細胞懸液。通過多色流式細胞術(shù)檢測小鼠脾臟和外周血中各種免疫細胞的表型特點及比例,并結(jié)合功能實驗,探索原頭節(jié)感染對宿主免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果,在感染后30天,表達CD11b、CD11c分子的細胞(即抗原遞呈細胞)比例增加,但其MHC-Ⅱ分子表達輕微下調(diào)。在整個實驗過程中,感染組小鼠固有免疫細胞如抗原遞呈細胞、GR-1+粒細胞比例均明顯增加,值得注意的是,共表達CD11b+/Gr-1+標志的髓源抑制性細胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSC)比例顯著升高。隨著感染進程深入,CD4+和CD8+T細胞表面激活標志CD69, CD44, CD40L的表達上調(diào),幼稚T細胞標志CD62L的表達下調(diào)；而CD4+/CD25+/Foxp3+T細胞(Treg)比例持續(xù)上升。感染組脾臟T細胞增殖能力顯著低于正常組水平(P0.05)。結(jié)果表明,原頭節(jié)感染Balb/c小鼠免疫系統(tǒng)環(huán)境發(fā)生了微妙改變,這種變化在慢性感染階段表現(xiàn)尤為明顯。伴隨著感染,T細胞被逐漸激活,但同時一些免疫抑制細胞如Treg、MDSC的比例持續(xù)增加,影響宿主針對蟲體抗原物質(zhì)的T細胞免疫應(yīng)答。本研究提示這些抑制性細胞在E. granulosus長期感染過程中可能發(fā)揮著極其重要的但尚被忽視的免疫下調(diào)作用。第二部分細粒棘球絳蟲原頭節(jié)感染小鼠M-MDSC源免疫調(diào)控分子的篩選髓源抑制性細胞(Meyloid-derived suppressor cells, MDSC)是一群異質(zhì)性細胞,來源于骨髓祖細胞和未成熟細胞,是DC、Macrophag e、粒細胞的前體。大量研究表明,MDSC在腫瘤模型中發(fā)揮著強大的免疫抑制作用。在第一部分,我們發(fā)現(xiàn)細粒棘球絳蟲原頭節(jié)感染可誘導MDSC在Balb/c、鼠外周血和脾臟中顯著富集,有助于E. granulosus抑制宿主抗蟲體免疫應(yīng)答,但具體作用機制研究仍不清楚。最新研究表明,單核型MDSC (monocytic-type MDSC, M-MDSD)是MDSC發(fā)揮免疫抑制作用的主要細胞群。本研究將以M-MDSC為模型,利用小鼠全基因表達譜篩選M-MDSC免疫調(diào)控相關(guān)分子,為E. granulosus免疫逃避機制提供新的見解。收集E. granulosus原頭節(jié)不同感染階段Balb/c小鼠脾臟以及對應(yīng)正常組小鼠脾臟,制備單細胞懸液,利用磁珠分選技術(shù)分離M-MDSC,提取總RNA進行小鼠全基因組表達譜分析。利用生物信息學對感染前后M-MDSC差異基因進行注釋及功能分析,并利用Real-time PCR驗證基因差異表達情況。結(jié)果表明,感染前后M-MDSC存在1090個差異基因。Real-time PCR驗證了27個差異基因,其中24個與芯片結(jié)果相符。蛋白網(wǎng)絡(luò)分析表明感染M-MDSC趨化能力和轉(zhuǎn)錄能力均減弱,可能影響M-MDSC的正常分化。同時,獲得了一批潛在功能分子,其差異表達可能影響DC、Mφ功能以及與T細胞相互作用,是MDSC發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的分子基礎(chǔ)。第三部分細粒棘球絳蟲原頭節(jié)排泄分泌蛋白基因轉(zhuǎn)錄特征分析原頭節(jié)是細粒棘球絳蟲的幼蟲階段,具有“雙向發(fā)育”的能力,能夠感染、適應(yīng)多種哺乳動物宿主,成為寄生蟲-宿主相互作用研究的重要模型。眾所周知,蟲體排泄分泌蛋白(excretory-secretory proteins, ESPs)在寄生蟲-宿主互作過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,是寄生蟲疫苗、診斷、藥物的重要靶標。但由于ESPs成分復雜,蛋白表達豐度不一,以及宿主蛋白的干擾等原因,利用蛋白質(zhì)組學不能完全解析ESPs組分。本研究利用454測序技術(shù)對綿羊流行株G1型細粒棘球絳蟲原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄組進行了測序,結(jié)合生物信息學方法重點分析了潛在ESPs基因轉(zhuǎn)錄特征,為全面了解細粒棘球絳蟲生理學適應(yīng)性奠定基礎(chǔ)。抽取細粒棘球絳蟲原頭節(jié)總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備cDN A。采用GS-FLX Titanium General Library Preparation Kit構(gòu)建cDNA文庫,利用Roche 454 GS-FLX Titanium平臺進行測序。測序結(jié)果經(jīng)除去低質(zhì)量Reads及測序接頭后拼接、組裝成原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄本。生物信息學方法提取轉(zhuǎn)錄本中潛在ESPs,探索其在原頭節(jié)生理適應(yīng)過程中的作用。本研究共獲得26514條Unigene,其中,22910條(86.4%)成功地比對到新近發(fā)布的細粒棘球絳蟲基因組序列,17705條(66.8%)分布在序列編碼區(qū)域。從原頭節(jié)轉(zhuǎn)錄本中共預測到2280條ESPs,138、124條分別參與碳水化合物、蛋白質(zhì)代謝。其中,11種ESPs作為胞內(nèi)酶參與調(diào)節(jié)糖酵解／糖異生作用；高表達的ESPs轉(zhuǎn)錄本包括44種抗原性蛋白,25種分子伴侶以及4種蛋白酶。此外,一些ESPs參與發(fā)育相關(guān)的信號通路,如TGF-β受體通路,insulin信號通路等。本研究表明原頭節(jié)分泌的ESPs不僅參與介導宿主免疫應(yīng)答,而且參與碳水化合物代謝、抵抗敵對的宿主內(nèi)環(huán)境以及參與發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵信號通路。研究結(jié)果將深化寄生蟲生理適應(yīng)性的認識,為包蟲病診斷、疫苗、藥物新靶標的篩選提供新的思路。結(jié) 論本課題從宿主-病原相互作用關(guān)系入手,探索細粒棘球絳蟲原頭節(jié)免疫逃避機制及生理適應(yīng)性,取得了如下結(jié)果：1.運用多色流式細胞術(shù)揭示E. granulosus原頭節(jié)感染后Balb/c小鼠脾臟和外周血中免疫細胞浸潤和激活過程中的關(guān)鍵事件：(1) APCs表面MHCⅡ分子表達明顯下調(diào),可能影響寄生蟲抗原遞呈；(2)感染雖能持續(xù)激活T細胞,但免疫抑制性細胞群(如Treg, MDSC)富集可能抑制其免疫應(yīng)答反應(yīng)。2.采用Agilent小鼠芯片篩選E. granulosus原頭節(jié)感染前后M-MDSC差異表達分子,發(fā)現(xiàn)原頭節(jié)感染明顯下調(diào)小鼠M-MDSC的趨化及轉(zhuǎn)錄相關(guān)分子表達,影響其正常分化及成熟；此外,一些差異表達分子可能影響其與T細胞相互作用,是M-MDSC發(fā)揮免疫調(diào)控的分子基礎(chǔ)。3.利用Roche 454測序解析了E. granulosi ts原頭節(jié)潛在排泄分泌蛋白(ESPs)基因轉(zhuǎn)錄特征：原頭節(jié)分泌的ESPs不僅參與介導宿主免疫應(yīng)答,而且參與碳水化合物代謝、抵抗敵對的宿主內(nèi)環(huán)境以及參與發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵信號通路。研究結(jié)果深化了寄生蟲生理適應(yīng)性認識,為包蟲病診斷、疫苗、藥物新靶標的篩選提供新的思路。
[Abstract]:Echinococcus granulosus ( Echinococcus granulosus ) has become a global public health problem . In addition , it can infect and adapt to various mammalian hosts . In addition , it can infect and adapt to various mammalian hosts .
In this study , the expression of CD69 , CD44 , CD40L and the expression of CD69 , CD44 and CD40L on CD4 + and CD8 + T cells were detected by multi - color flow cytometry , and the expression of CD69 , CD44 and CD40L was regulated by multi - color flow cytometry .
In the first part , we found that MDSC can induce MDSC to play an important role in immune response in Balb / c mice . In this study , we sequenced the expression of M - MDSC . The results showed that there were 1090 differentially expressed genes in M - MDSCs .
In addition , some ESPs are involved in the development of related signaling pathways , such as TGF - 尾 receptor pathway , insulin signaling pathway , etc . The study shows that ESPs are not only involved in mediating host immune response , but also involved in carbohydrate metabolism , resistance to hostile host internal environment and key signal pathways involved in development .
( 2 ) Although T cells were continuously activated by infection , the enrichment of immunosuppressive cells ( such as Treg , MDSC ) could inhibit the immune response .
In addition , some differentially expressed molecules may influence their interaction with T cells , which is a molecular basis for the immune regulation of M - MDSCs . ESPs secreted by the primary segment are not only involved in mediating host immune responses but also participating in carbohydrate metabolism , resisting hostile host internal environment and key signal pathways involved in development .
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R532.32

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本文編號：1961255