本文選題：單核細胞 + 阿薩希毛孢子菌�。� 參考：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景和目的:阿薩希毛孢子菌(Trichosporon asahii,T.asahii)是一種酵母樣真菌,可導致侵襲性、播散性感染。T.asahii導致的播散性毛孢子菌病,致死率高達80%。T.asahii感染人體的結局,主要與宿主的免疫防御狀態(tài)和菌株對抗真菌藥物敏感性這兩方面因素有關。本研究應用人全基因組寡核苷酸芯片檢測了人THP-1單核細胞與T.asahii體外相互作用3小時后的基因表達譜變化,有助于理解宿主單核細胞對T.asahii感染的免疫防御機制。研究表明,單核細胞的吞噬功能明顯弱于巨噬細胞,而單核細胞只占外周血白細胞總數的3%-8%,這可能是其難以抵擋T.asahii入侵,導致血源性、播散性感染的原因之一。粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor,GM-CSF)作為一種重要的集落刺激因子,可促進造血干細胞向中性粒細胞和單核/巨噬細胞分化、增殖。我們進一步研究了GM-CSF對單核細胞吞噬、殺傷T.asahii功能的影響,探討應用GM-CSF輔助治療T.asahii感染的可能性。研究表明,T.asahii感染所致的播散性毛孢子菌病,其高死亡率與菌株耐藥及T.asahii形成生物膜的能力密切相關。由于研發(fā)新型抗真菌藥物周期長,投資巨大,在已有藥物中發(fā)掘抗真菌藥物增效劑成為近年來抗真菌感染領域的研究熱點。為了解決臨床常見的T.asahii耐藥問題,我們查閱了國內外關于抗真菌藥物增效劑的相關文獻,選擇舍曲林及鹽酸小檗堿作為藥物增效劑,進行了體外藥敏試驗,觀察它們聯合應用氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑及兩性霉素B對T.asahii游離細胞及生物膜是否有協(xié)同抑制作用,試圖篩選出既有協(xié)同抗菌作用,又可抑制生物膜形成的輔助治療藥物。方法:第一部分:人THP-1單核細胞對T.asahii感染的基因表達譜反應1.1×107人THP-1單核細胞與5×107CFU的T.asahii細胞在37℃RPMI 1640液體培養(yǎng)基中混合培養(yǎng)3小時。Trizol一步法提取THP-1細胞中的總RNA。應用人全基因組寡核苷酸芯片檢測人THP-1單核細胞與T.asahii體外作用3小時的基因表達譜變化,應用SAM軟件以2倍標準篩選差異表達基因,進一步應用DAVID6.7生物信息學分析系統(tǒng)對差異表達基因進行基因功能聚類分析。2.Real time PCR檢測部分差異表達基因m RNA的表達,以驗證基因表達譜數據。3.ELISA法檢測TNF-α、IL-1β及CCL3在蛋白水平的表達變化,以驗證基因表達譜數據。第二部分:粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)對人THP-1單核細胞抗T.asahii感染活性的增強作用1.GM-CSF對人THP-1單核細胞吞噬T.asahii的影響:將1cm×1cm大小的圓形蓋玻片置于24孔板,加入500μl濃度為1×105/ml的人THP-1單核細胞。實驗組加入終濃度為100、200、400U/ml的重組人GM-CSF,37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中預孵育48小時。對照組加入不含重組人GM-CSF的RPMI 1640液體培養(yǎng)基。48小時后,每孔加入500μl濃度為5×105 CFU/ml的T.asahii菌懸液(MOI=5:1),37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)1小時,吸棄上清液,PBS輕柔洗滌2遍,取出圓形蓋玻片置于載玻片上,加瑞氏-姬姆薩染液進行染色、固定,自然干燥后在顯微鏡下觀察THP-1細胞對T.asahii的吞噬現象。2.GM-CSF對人THP-1單核細胞殺傷T.asahii功能的影響:96孔板每孔加濃度為1×105/ml的人THP-1單核細胞懸液100μl,同時各實驗組分別加入終濃度為100、200、400U/m的重組人GM-CSF,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48h,對照組加入不含重組人GM-CSF的RPMI 1640液體培養(yǎng)基。48小時后,棄上清液,用RPMI 1640液體培養(yǎng)基洗2遍,每孔加入濃度為5×106 CFU/ml的T.asahii菌懸液100μl,37℃、5%CO2條件下共培養(yǎng)1小時。吸取上清液轉移到另一96孔板;原96孔板每孔加入100μl 2%的Triton X-100作用10分鐘,裂解THP-1細胞;取細胞裂解后釋放出的T.asahii的上清液與裂解前上清液混合,混勻后倍比稀釋100倍。吸取200μl,加入15ml 50℃的SDA真菌培養(yǎng)基中,搖勻、凝固后于37℃真菌培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48h,觀察每個平皿形成的菌落數,計算每毫升的T.asahii菌落形成單位(CFU/ml)及對T.asahii的生長抑制率。第三部分:舍曲林、鹽酸小檗堿聯合抗真菌藥物對T.asahii游離細胞及生物膜的體外協(xié)同抗菌作用1.舍曲林、鹽酸小檗堿聯合抗真菌藥物對T.asahii游離細胞的體外藥敏試驗:(1)21株T.asahii臨床株的復蘇、純化與菌液制備;(2)96孔藥敏板的制備;(3)最低抑菌濃度(MIC)的結果判讀:采用肉眼觀察比較各孔與生長對照孔的濁度變化來判斷MIC值。所有檢測藥物均設置50%生長抑制(MIC50)及100%生長抑制(MIC100)2個判讀終點;(4)聯合用藥效果評價:采用部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index,FICI)判斷聯合用藥兩種藥物間相互作用的效果。2.舍曲林、鹽酸小檗堿聯合抗真菌藥物對T.asahii生物膜的體外藥敏試驗:(1)T.asahii臨床株的復蘇、純化與菌液制備;(2)在96孔板中構建T.asahii生物膜體外模型;(3)T.asahii生物膜藥敏板的制備;(4)T.asahii生物膜最低抑菌濃度(sessile MIC,SMIC)的結果判讀:采用XTT還原比色法比較各孔與生長對照孔的OD值變化來計算SMIC值,所有檢測藥物均設置50%生長抑制(SMIC50)及80%生長抑制(SMIC80)2個判讀終點;(5)聯合用藥效果評價:采用部分抑菌濃度指數(fractional inhibitory concentration index,FICI)判斷聯合用藥兩種藥物間相互作用的效果。結果:第一部分:人THP-1單核細胞對T.asahii感染的基因表達譜反應1.人THP-1單核細胞與T.asahii體外相互作用后的基因表達譜變化:共篩選出1315個差異表達基因,其中463個基因表達明顯上調,852個基因表達明顯下調。應用DAVID 6.7進行基因功能注釋聚類分析,上調的基因共得到30個GO基因注釋聚類和1個KEGG pathway注釋聚類,下調的基因共得到33個GO基因注釋聚類和1個KEGG pathway注釋聚類。生物信息學分析提示上調的差異表達基因主要涉及固有免疫反應、適應性免疫反應、炎癥反應、凋亡和抗凋亡等生物學反應。下調的差異表達基因主要涉及細胞周期、有絲分裂、DNA修復等生物學過程。上調幅度最大的基因主要為編碼促炎細胞因子及趨化因子的基因。2.Real time PCR驗證基因表達譜數據:IL-1β、TNF-α、CCL3、NF-κB1、TLR4及NLRP3在m RNA水平的表達明顯上調,CCR2的表達明顯下調,Real time PCR與基因表達譜芯片檢測同一基因的表達變化趨勢一致。3.ELISA法驗證基因表達譜數據:人THP-1單核細胞與T.asahii體外相互作用3 h、6 h、9h及12 h后,TNF-α、IL-1β及CCL3的蛋白表達水平均明顯高于對照組(P0.05),與基因表達譜同一基因的表達變化趨勢一致。第二部分:粒-巨噬細胞集落刺激因子對人THP-1單核細胞抗T.asahii感染活性的增強作用1.GM-CSF對人THP-1單核細胞吞噬T.asahii的影響:重組人GM-CSF預孵育可使人THP-1單核細胞對T.asahii的吞噬率(相互作用1小時)從20%提高到84%左右。人THP-1單核細胞對T.asahii的吞噬率隨重組人GM-CSF濃度(100U/ml、200U/ml及400U/ml)增高而升高,具有濃度依賴性。2.GM-CSF對人THP-1單核細胞殺傷T.asahii功能的影響:200U/ml及400U/ml的重組人GM-CSF預孵育組,每毫升T.asahii菌落形成單位較對照組明顯減少(P0.05)。第三部分:舍曲林、鹽酸小檗堿聯合抗真菌藥物對T.asahii游離細胞及生物膜的體外協(xié)同抗菌作用1.舍曲林、鹽酸小檗堿聯合抗真菌藥物對T.asahii游離細胞的體外藥敏試驗:舍曲林單藥對21株T.asahii臨床株的MIC50為4-8μg/ml,MIC100為8-32μg/ml。舍曲林與抗真菌藥物聯合應用可明顯降低氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B對T.asahii游離細胞的MIC50及MIC100。舍曲林與氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑及兩性霉素B對大部分T.asahii菌株均有明顯的協(xié)同抗菌作用(FICI≤0.5)。其中與兩性霉素B的協(xié)同作用最強,90.5%的菌株(19株)觀察到舍曲林與兩性霉素B聯合應用有協(xié)同抗菌作用。鹽酸小檗堿單藥對所有T.asahii菌株的MIC50及MIC100均128μg/ml。鹽酸小檗堿與抗真菌藥物聯合應用可明顯降低氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B對T.asahii游離細胞的MIC50及MIC100。鹽酸小檗堿與氟康唑、及兩性霉素B對大部分T.asahii菌株均有明顯的協(xié)同抗菌作用(FICI≤0.5)。其中與兩性霉素B的協(xié)同作用最強,71.4%的菌株(15株)觀察到舍曲林與兩性霉素B聯合應用有協(xié)同抗菌作用。2.舍曲林、鹽酸小檗堿聯合抗真菌藥物對T.asahii生物膜的體外藥敏試驗:舍曲林單藥對T.asahii生物膜顯示出明顯的抑制作用(SMIC50 16-32μg/ml,SMIC8032-64μg/ml)。舍曲林與抗真菌藥物聯合應用可明顯降低氟康唑、兩性霉素B對T.asahii生物膜的SMIC50,但對四種抗真菌藥物的SMIC80無明顯影響。舍曲林與兩性霉素B聯合應用對T.asahii生物膜有較明顯的協(xié)同抑制作用,81%的菌株(17株)觀察到舍曲林與兩性霉素B聯合應用對T.asahii生物膜有協(xié)同抑制作用,而舍曲林聯合應用三種唑類抗真菌藥物對T.asahii生物膜未見明顯的協(xié)同抑制作用。鹽酸小檗堿單藥對所有21株T.asahii臨床株生物膜均無明顯抑制作用(SMIC50及SMIC100均128μg/ml)。鹽酸小檗堿與抗真菌藥物聯合應用可降低氟康唑、兩性霉素B對T.asahii生物膜的SMIC50,但對四種抗真菌藥物的SMIC80無明顯影響。鹽酸小檗堿聯合應用三唑類抗真菌藥物對T.asahii生物膜未見明顯的協(xié)同抑制作用。28.6%的菌株(6株)觀察到鹽酸小檗堿與兩性霉素B聯合應用對T.asahii生物膜有協(xié)同抑制作用,但有協(xié)同作用的比例較低,需要擴大樣本量以進一步驗證兩者的協(xié)同作用。結論:1.本課題的基因表達譜研究在轉錄水平上揭示了宿主單核細胞對T.asahii感染的整體反應。人THP-1單核細胞遭遇T.asahii感染,可出現大量抗真菌感染免疫及細胞生物學相關基因的差異表達。其中,表達上調幅度最高的均是編碼促炎細胞因子的基因,如TNF-α、IL-1β及CCL3等,提示人THP-1單核細胞可通過上調促炎細胞因子、趨化因子等炎性介質的表達,產生強大的炎癥反應,發(fā)揮抗T.asahii感染作用。此外,部分適應性免疫反應相關基因的表達明顯上調,提示人THP-1單核細胞試圖進一步激活適應性免疫反應以增強宿主抗T.asahii感染的能力。2.重組人GM-CSF可明顯增強人THP-1單核細胞對T.asahii的吞噬、殺傷活性。應用重組人GM-CSF輔助治療T.asahii播散性感染是一種可行的治療策略。3.舍曲林有明顯的體外抑制T.asahii游離細胞及生物膜活性。對于應用醫(yī)療植入物等有形成T.asahii生物膜風險的重癥患者,舍曲林以其明顯的抗T.asahii生物膜活性及較小的副作用,顯示出很好的臨床應用價值。舍曲林及鹽酸小檗堿可提高T.asahii對氟康唑、兩性霉素B等常用抗真菌藥的敏感性,可作為輔助治療T.asahii播散性感染的新型藥物增效劑。4.增強單核細胞免疫防御功能及提高病原真菌對抗真菌藥物的敏感性是抗T.asahii播散性感染的有效策略。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R756

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本文編號：1902156