本文選題：T細胞亞群 + 共刺激分子�。� 參考：《蘇州大學》2016年博士論文

【摘要】：血吸蟲病是一種嚴重危害人類健康的傳染性疾病,廣泛流行于亞洲、非洲和拉丁美洲,被世界衛(wèi)生組織列為被忽視的熱帶病之一(Neglected Tropical Diseases,NTD)。血吸蟲病致病的中心環(huán)節(jié)是肝臟蟲卵肉芽腫和繼發(fā)的肝臟纖維化,其原因主要是由于T淋巴細胞細胞亞群分化和功能異常介導的免疫病理損傷,特別是CD4+T(Th)亞群在感染不同階段改變介導了持續(xù)對蟲卵抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答所致病理改變,但確切的機制尚待探討。已有研究表明,Th1/Th2免疫偏移與血吸蟲病免疫病理損傷——蟲卵肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展及其免疫調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)。Th17和Tfh是近年來備受關(guān)注的參與血吸蟲感染免疫和病理進程相關(guān)的Th細胞亞群。因此,宿主感染血吸蟲后誘發(fā)Th細胞亞群(Th1/Th2/Th17/Tfh)功能的失衡可能是血吸蟲免疫病理機制的重要因素,值得進一步探討。迄今對于T細胞免疫應(yīng)答在血吸蟲感染免疫應(yīng)答的研究絕大多數(shù)集中于CD4+T細胞及其亞群,而對于CD8+T細胞研究甚少。有研究認為,CD8+T細胞在曼氏血吸蟲感染宿主過程中可能具有抑制免疫病理的作用,但尚未有確切證據(jù)證實。因此,研究T細胞亞群在血吸蟲病不同病理階段的改變和介導的免疫應(yīng)答類型,尋找調(diào)控T細胞亞群免疫失衡的靶點,對防治血吸蟲病免疫病理損傷,研究和尋找新的免疫干預(yù)措施具有十分重要的意義。業(yè)已證明,T細胞的有效活化和功能介導需要雙重信號的協(xié)同作用:一是抗原肽—MHC復合物,被T細胞抗原受體(TCR)識別;二是共刺激信號,由抗原提呈細胞(APC)和T細胞表面的共刺激分子配體和受體相互作用所介導�？烧T導共刺激分子(Inducible costimulator mocule,ICOS)和程序性死亡受體1(Programmed death-1,PD-1)是介導T細胞有效激發(fā)、適度效應(yīng)和適時中止的重要的正性和負性調(diào)控分子,共刺激分子與其配體(ICOS/ICOSL和PD-1/PD-L1)介導的信號對宿主調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答起重要作用,因而成為腫瘤免疫、感染免疫和自身免疫性疾病的研究熱點。本課題以血吸蟲感染小鼠為實驗動物模型,以t細胞亞群為主線,探討t細胞和相關(guān)免疫分子特別是正性共刺激分子icos/icosl和負性共刺激分子pd-1/pd-l1,在血吸蟲感染以及再感染不同階段的作用,研究其與血吸蟲所致宿主免疫病理變化的相關(guān)性,并進一步觀察對血吸蟲感染模型進行icos/icosl和pd-1/pd-l1信號途徑體內(nèi)干預(yù)的研究,探討正性共刺激信號icos和負性共刺激信號pd-1對血吸蟲感染宿主關(guān)鍵的免疫病理損傷——蟲卵肉芽腫反應(yīng)的調(diào)控作用,為血吸蟲病病理損傷的免疫干預(yù)提供新的思路。第一部分t細胞亞群和相關(guān)分子在血吸蟲感染小鼠模型中的表達及與肝臟病理變化的相關(guān)性目的:觀察血吸蟲感染小鼠不同階段t細胞亞群和th亞群(th1/th2/th17/tfh)以及相關(guān)分子的表達變化,平行性觀察感染不同階段血吸蟲病肝臟病理變化。方法:balb/c小鼠以腹部貼片法建立血吸蟲感染動物模型;采用多參數(shù)熒光標記流式細胞術(shù)檢測血吸蟲感染小鼠不同階段t細胞亞群、th細胞亞群(th1/th2/th17/tfh)以及共刺激分子icos/icosl和pd-1/pd-l1的表達;應(yīng)用熒光定量pcr的方法檢測同期小鼠th亞群(th1/th2/th17/tfh)轉(zhuǎn)錄因子表達水平;采用免疫組化he染色觀察血吸蟲主要免疫病理損傷——肝臟蟲卵肉芽腫的反應(yīng)進程,分析其與t細胞亞群、th亞群(th1/th2/th17/tfh)以及共刺激分子icos/icosl、pd-1/pd-l1表達的相關(guān)性。結(jié)果:(1)小鼠肝臟免疫組化he染色,對不同階段感染小鼠的肝臟蟲卵肉芽腫面積的分析表明,血吸蟲病感染后8w,宿主對于血吸蟲免疫應(yīng)答的蟲卵肉芽腫反應(yīng)最強。(2)流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示,感染血吸蟲后3w小鼠外周血和脾臟cd4+t細胞下降,cd8+t細胞升高,于感染第8w達最高值;(3)小鼠脾臟和淋巴結(jié)中tfh從感染3周即出現(xiàn)升高,而外周血tfh感染8w后升高。感染小鼠血清中特異性抗體水平igg與脾臟tfh細胞比例成正相關(guān)。(4)th1細胞因子ifn-γ于感染1w即升高,于第5w(蟲卵形成期)出現(xiàn)下調(diào),隨后逐漸下降;th2型細胞因子il-4以及th17型細胞因子il-17均于感染6w后升高,并持續(xù)維持在較高水平;tfh型細胞因子il-21于感染3w出現(xiàn)升高,感染10w達到峰值,感染后期維持在較高水平;脾臟中th1/th2/th17/tfh特異性轉(zhuǎn)錄因子(tbet/roryt/gata3/bcl-6)動態(tài)變化與其相應(yīng)細胞因子動態(tài)變化一致;(5)cd4+t細胞上共刺激分子icos和pd-1在血吸蟲感染后表達上調(diào);其配體在cd19+b細胞上調(diào)表達。結(jié)論:血吸蟲感染引起宿主cd4+t細胞的降低和cd8+t細胞的升高;宿主t細胞免疫應(yīng)答感染初期以th1應(yīng)答為主,隨著病程進入蟲卵抗原產(chǎn)生至宿主肝臟蟲卵肉芽腫的形成和發(fā)展,th2、th17、tfh免疫應(yīng)答增強,t細胞表面共刺激分子pd-1和icos表達顯著升高,其配體表達上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)蟲卵肉芽腫與cd8+t比例關(guān)系密切,特異性抗體水平igg與脾臟tfh細胞比例成正相關(guān),值得進一步探討。第二部分t細胞亞群和相關(guān)分子在血吸蟲再感染小鼠模型的表達及與病理變化的相關(guān)性目的:分析宿主初次感染、再感染及化療后體內(nèi)t細胞亞群、th細胞亞群(th1/th2/th17/tfh)和共刺激分子表達水平的變化,探討t細胞亞群、th細胞和共刺激分子icos和pd-1在血吸蟲再感染宿主中免疫應(yīng)答的特征,為尋找預(yù)防血吸蟲再感染和抑制宿主免疫病理的干預(yù)措施奠定基礎(chǔ)。方法:balb/c小鼠以腹部貼片法建立小鼠初次感染、再感染和治療后的動物模型。采用流式細胞術(shù)觀察血吸蟲感染小鼠在再感染、初次感染及化療后狀態(tài)下體內(nèi)t細胞亞群、th細胞亞群以及共刺激分子pd-1和icos的的表達水平;免疫組化方法觀察感染小鼠的血吸蟲蟲卵肉芽腫的病理變化;探討t細胞亞群、th細胞亞群及icos/icosl和pd-1/pd-l1與再感染狀態(tài)下免疫病理變化的相關(guān)性。結(jié)果:(1)化療組小鼠外周血和脾臟cd4+t比例較感染組小鼠升高,cd8+t比例較感染組小鼠降低,icos/icosl和pd-1/pd-l1的表達較感染組均下調(diào),il-4、il-17均出現(xiàn)不同程度的降低,而ifn-γ無明顯改變,由此表明化療組小鼠的th2/th17/tfh型免疫反應(yīng)均呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢;(2)再感染組小鼠外周血和脾臟中cd4+t比例較初次感染組比例升高,cd8+t比例降低,外周血icos和pd-1與初次感染組比較沒有顯著性差異,而脾臟cd4+t上icos和pd-1上調(diào)表達;再感染組與初次感染組比較ifn-γ和il-4未見顯著性差異,而再感染組il-17和il-21型細胞因子較初次感染組低;(3)血吸蟲再感染小鼠較初次感染小鼠的蟲荷數(shù)減少,初次感染對于再感染宿主有19.9%的保護率;再感染組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫的面積與初次感染組無差別。結(jié)論:再感染宿主t細胞亞群以及th細胞亞群與初次感染時呈現(xiàn)出不同的特征,再感染宿主cd4+t比例較初次感染時升高,cd8+t比例雖仍高于正常對照組,但與初次感染相比出現(xiàn)下降,th17和tfh免疫應(yīng)答反應(yīng)較初次感染時下調(diào),而外周血和脾臟cd4+t細胞共刺激分子pd-1和icos的表達較初次感染時上調(diào),其配體表達與初次感染無明顯差異。第三部分icos/icosl和pd-1/pd-l1信號體內(nèi)干預(yù)及聯(lián)合砒喹酮治療對血吸蟲感染小鼠作用及機制研究目的:觀察icos/icosl和pd-1/pd-l1信號體內(nèi)干預(yù)及聯(lián)合砒喹酮治療對血吸蟲病免疫病理損傷的治療作用,探討pd-1/pd-l1信號激發(fā)聯(lián)合砒喹酮治療對減輕血吸蟲病免疫病理損傷的可能作用機理,為血吸蟲病肝臟病理損傷的免疫干預(yù)措施提供實驗依據(jù)。方法:對balb/c小鼠的血吸蟲感染模型在感染6w(蟲卵肉芽腫形成期)時進行icos/icosl和pd-1/pd-l1信號的體內(nèi)干預(yù)。血吸蟲感染小鼠進行正性共刺激信號icos阻斷(icos阻斷性抗體,anti-icoslmab)或負性信號增強(pd-l1重組蛋白,pd-l1.fc)的干預(yù)措施,同時聯(lián)合砒喹酮進行殺蟲治療,觀察正性信號icos和負性信號pd-1干預(yù)對血吸蟲病治療作用和免疫病理損傷的影響;由于發(fā)現(xiàn)負性信號增強(pd-l1.fc)和吡喹酮聯(lián)合干預(yù)能明顯減輕和抑制肝臟病理損傷,因此進一步在小鼠感染血吸蟲的不同階段(感染3w、6w、12w),采用增強pd-1信號的pd-l1.fc和阻斷pd-1信號的anti-pd-l1mab對pd-1/pd-l1信號激發(fā)或者阻斷干預(yù),采用流式細胞術(shù)分析觀察干預(yù)后cd4+t、cd8+t、cd19+b細胞的變化以及病理形態(tài)分析,觀察其對病理損傷的影響。結(jié)果:(1)正性信號抑制(anti-icoslmab)聯(lián)合吡喹酮治療小鼠肝臟肉芽腫面積與單獨砒喹酮治療組小鼠無顯著性差異;(2)吡喹酮聯(lián)合負性信號增強即pd-l1.fc干預(yù)組小鼠肝臟肉芽腫面積低于單獨砒喹酮治療組小鼠,由此表明pd-l1信號增強干預(yù)可顯著減輕血吸蟲感染小鼠蟲卵肉芽腫的病理損傷;(3)在此基礎(chǔ)上,對小鼠感染血吸蟲不同階段(3w、6w和12w)進行pd-1/pd-l1信號阻斷(anti-pd-l1mab)的免疫干預(yù),結(jié)果顯示小鼠外周血、脾臟pd-1分子在cd4+t和cd8+t淋巴細胞表面表達下調(diào)、pdl-1分子在cd19+b細胞表達下調(diào),在不同階段負性阻斷干預(yù)對血吸蟲病肝臟病理沒有顯著影響,cd8+t細胞比例與感染組小鼠無顯著性差異;(4)對小鼠感染血吸蟲不同階段(3w、6w和12w)進行pd-1/pd-l1信號增強的免疫干預(yù),結(jié)果顯示小鼠外周血、脾臟pd-1分子在cd4+t和cd8+t淋巴細胞表面表達上調(diào)、pdl-1分子在cd19+b細胞表達上調(diào),在小鼠感染血吸蟲3w和6w干預(yù)小鼠病理損傷減輕,pd-1/pd-l1信號增強的免疫干預(yù)組,cd8+t細胞比例明顯下降,尤其是pd-1/pd-l1信號增強聯(lián)合吡喹酮治療組,小鼠病理損傷顯著地減輕,并可殺滅成蟲,同時cd8+t細胞比例低于單獨干預(yù)組;而感染12w進行干預(yù)對小鼠肝臟病理沒有明顯作用。結(jié)論:正性信號阻斷(anti-icoslmab)和負性信號阻斷(anti-pd-l1mab)對血吸蟲感染小鼠的免疫病理沒有顯著影響;而pd-1/pd-l1信號增強(pd-l1.fc)聯(lián)合吡喹酮治療,殺成蟲的同時可明顯減輕血吸蟲感染小鼠蟲卵肉芽腫的病理損傷,且cd8+t細胞明顯下降。同時證實pd-l1早期干預(yù)聯(lián)合吡喹酮治療血吸蟲病可顯著減輕血吸蟲感染引起的不可逆的肝臟病理損傷,有潛在的應(yīng)用前景。本論文研究表明,感染血吸蟲宿主的免疫應(yīng)答過程中,t細胞亞群隨著疾病病程進展過程而變化,呈現(xiàn)cd4+t細胞持續(xù)下降,cd8+t細胞升高的特征,尤其在蟲卵肉芽腫反應(yīng)最強的8w,cd8+t細胞也達到最高值;伴隨著疾病從急性向慢性反應(yīng)的轉(zhuǎn)歸,th細胞亞群的動態(tài)變化和調(diào)節(jié)呈現(xiàn)出與慢性感染性疾病一致的特征,即在感染初期誘導以th1為主的細胞免疫應(yīng)答,感染后期th2/th17/tfh免疫應(yīng)答增強并對宿主的免疫病理損傷起重要的調(diào)節(jié)作用;本研究首次發(fā)現(xiàn)pd-1/pd-l1信號的增強可明顯減輕血吸蟲病免疫病理損傷,且引起感染宿主體內(nèi)cd8+t的降低,pd-l1.fc聯(lián)合血吸蟲化療藥物吡喹酮不僅可殺滅成蟲,也顯著改善血吸蟲病免疫病理損傷。綜上所述,本論文動態(tài)地分析了血吸蟲感染小鼠模型t細胞亞群的變化規(guī)律,探討了共刺激分子icos/icosl和pd-1/pd-l1在血吸蟲病免疫病理的表達及其調(diào)節(jié)機制,發(fā)現(xiàn)pd-1/pd-l1信號的增強可明顯減輕血吸蟲病免疫病理損傷,提示血吸蟲感染所致的肝臟蟲卵肉芽腫,繼而發(fā)展為肝臟纖維化病變,與過度的炎癥損傷相關(guān),而pd-1可有效地調(diào)控過度的炎癥反應(yīng)及產(chǎn)生的病理損傷。本研究提出了靶向共刺激信號pd-1/pd-l1聯(lián)合吡喹酮化療的干預(yù)措施,這不僅為血吸蟲病免疫病理機制研究提出新的思路,而且為預(yù)防和治療血吸蟲病病理損害提供新的治療方案。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R532.21

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本文編號：1801505