本文選題：HIV-1疫苗　切入點：佐劑　出處：《中國疾病預防控制中心》2016年博士論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒-1型(Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)發(fā)現(xiàn)至今已有三十多年,人們對其發(fā)病機理和免疫學特征也有了一定的認識,但制約HIV-1疫苗研發(fā)的主要科學和技術障礙仍未能跨越,有效阻止機體感染的疫苗尚未研發(fā)成功。HIV-1具有極高的遺傳多樣性,并且進化出了許多機制來逃避機體免疫系統(tǒng)的攻擊。誘導持久的細胞免疫反應和廣譜中和抗體是HIV-1疫苗發(fā)展的兩個重要目標。細胞免疫反應的強度和持久性受外來免疫原和體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)因子的影響。細胞因子Interleukin-21 (IL-21)作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子,其受體廣泛表達于各種免疫細胞表面,在調(diào)節(jié)免疫反應時具有多重效應性,因而,近年來IL-21被當作調(diào)節(jié)疫苗免疫的佐劑廣泛應用于疫苗的免疫策略中來提高機體免疫應答反應�，F(xiàn)今,部分HIV-1疫苗可以誘導出毒株特異性的中和抗體,但很難誘導出廣譜中和抗體,誘導的細胞免疫反應也多不持久,這是阻礙HIV-1疫苗研究的技術瓶頸。在HIV-1自然感染者中,少部分(10%～25%)感染者中存在廣譜中和血清反應,機體能夠在和病毒的長期斗爭中產(chǎn)生廣譜中和抗體。從這些感染者中尋找廣譜中和抗體,并深入研究其產(chǎn)生發(fā)展和成熟的過程,是一項重要的保護性體液免疫機制研究,其結果將有助于設計能誘導廣譜中和抗體的新型疫苗,同時也為治療提供了備選的免疫制劑。本論文研究針對以上HIV-1疫苗研究的兩個重要領域,展開兩個方面的研究。一、細胞因子佐劑IL-21調(diào)節(jié)HIV-1疫苗誘導細胞免疫反應的研究本研究系統(tǒng)評價了HIV-1 DNA疫苗初免-rTV/蛋白疫苗加強免疫策略在小鼠中誘導的免疫應答反應,發(fā)現(xiàn)該免疫策略能夠誘導出廣泛持久的HIV-1特異性抗體反應(IgG、IgM、IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)、特異性細胞因子的分泌(IFN-γ、IL-2和TNF-α)和多功能性T細胞。然后以此為基礎,以細胞因子IL-21為佐劑與疫苗共免疫小鼠,觀察IL-21對疫苗誘導免疫反應的調(diào)節(jié)效應,結果發(fā)現(xiàn)IL-21能夠提高Thl型免疫反應、顯著增強CD4+T細胞和CD4+ TEM細胞分泌特異性IFN-γ和]TNF-α的能力,顯著提高多功能性CD4+T細胞和CD4+ TEM細胞的比例、顯著提高NK細胞的比例。二、HIV-1單克隆廣譜中和抗體的篩選及其進化成熟機制研究本部分研究以本實驗室發(fā)現(xiàn)的中國可產(chǎn)生廣譜中和抗體的H1V-1感染者為切入點,分離出了多個中和寬度有限的HIV-1中和抗體,并對其中一個感染者2005年至2009年血液樣本進行深入研究,系統(tǒng)分析了廣譜中和抗體的發(fā)生發(fā)展和成熟的過程。通過與TSRI (The Scripps Research Institute)科學家合作單細胞分選分離得到了產(chǎn)生抗HIV-1膜蛋白抗體的B細胞。采用單克隆抗體擴增和表達技術獲得了單克隆抗體DRVIA7;特異性表位分析確定該抗體靶向CD4結合位點(CD4bs);經(jīng)Global和DRVI兩個中和測定盤(Global Panel, DRVI Panel)標定,發(fā)現(xiàn)其具有抗HIV-1中和活性,但其中和寬度有限(33%,36%)�；蚍治霭l(fā)現(xiàn)其重鏈來源于IgHV1-02*02家系、體細胞突變率為19%,輕鏈來源于IgKV1-05*03、體細胞突變率為17%,可能為一種類VRC01中和抗體。合作單位TSRI科學家對該單克隆抗體的晶體結構進行了解析,證實了DRVIA7為一種類VRC01抗體,將其與VRC01抗體結構進行比較發(fā)現(xiàn),DRVIA7抗體的輕鏈N端和LCDR1區(qū)與gp120上的V5區(qū)和N276關鍵糖位處存在結構沖突,DRVIA7抗體與去糖基化gp120抗原的結合能力明顯提升,實驗證實該結構差異確實影響到了抗體的結合能力,解釋了該抗體中和寬度有限的可能原因。在上述結構分析的指導下,我們通過基因改造刪掉DRVIA7輕鏈N端兩個氨基酸和替換VRC01 LCDR1區(qū),拓寬了DRVIA7抗體的中和寬度,也證實了糖位對抗體中和能力的影響。改造抗體在Global Panel和DRVI Panel上的中和寬度分別為100%和72%,能夠中和VRC01耐受的BJOX2000病毒。通過DRV1A7和VRC01抗體的輕重鏈交叉配對發(fā)現(xiàn)該抗體重鏈和輕鏈進化成熟不一致,重鏈具備了較強的中和能力,當與VRC01輕鏈配對時,抗體中和寬度與VRC01相當(Global Panel:100% vs. 92%, DRVI Panel:92% vs.96%),而且能夠中和4個VRC01耐受的病毒(BJOX2000, DU172,57128,3817),但是輕鏈未完全進化,配對抗體的中和能力較弱。經(jīng)與TSRI科學家合作,開展深度測序和生物信息學分析,對該感染者體內(nèi)抗體組學進行系統(tǒng)的研究,同時我們對挑選出的抗體基因進行體外功能驗證。分析發(fā)現(xiàn)DRVIA7-家系抗體基因在2006年之前開始出現(xiàn),2008年達到高峰,2009年規(guī)模開始衰退。對于重鏈基因而言,2006年挑選出的前體基因已經(jīng)具備了較強的中和能力(Global Panel:1.25 μg/ml,93%; DRVI Panel:0.84 μg/ml,86%),到2008年中和能力更強(Global Panel:0.92 μg/ml,90%; DRVI Panel:0.74 μg/ml, 92%),說明重鏈基因可以在2年的時間內(nèi)快速成熟,2009年中和強度達到最高(Global Panel:0.54 μg/ml,98%; DRVI Panel:0.36 μg/ml,96%);對于輕鏈基因而言,2006年已經(jīng)具備了VRCOl-like LCDR3特征,但是在2009年抗體基因庫中僅發(fā)現(xiàn)一條具備較強中和能力的輕鏈(Global Panel:6.62 μg/ml,75%; DRVI Panel: 2.27 μg/ml,60%),說明機體沒能完全跨越輕鏈成熟的障礙大量獲得更高強度的中和抗體,但同時也說明了機體免疫系統(tǒng)確實也在通過進化嘗試跨越這種障礙。通過感染者自身來源的輕重鏈配對獲得了中和能力更強的抗體(Global Panel: 83% vs.33%)也證實了這一點,雖然配對抗體輕重鏈不一定來自同一個B細胞,但是說明機體自身免疫系統(tǒng)有可能進化出更強的廣譜中和抗體。綜上所述,本研究描述了細胞因子IL-21對HIV-1疫苗誘導細胞免疫的增強效應,為其作為一種佐劑應用于疫苗免疫提供了更多的臨床前數(shù)據(jù)支持。本研究首次從中國HIV-1感染者體內(nèi)分離得到了單克隆廣譜中和抗體,證實gp120上關鍵糖位阻礙了抗體輕鏈的成熟,闡明該分枝抗體的發(fā)展成熟過程,一方面得到了一系列廣譜中和能力強的單抗制劑,另一方面也為可誘導廣譜中和抗體疫苗的免疫原設計提供了理論支持和設計思路,在設計靶向該位點的疫苗時應當考慮gp120上關鍵糖位,同時設計靶向激活該類抗體前體的疫苗可能誘導出廣譜中和抗體。本研究在一定程度上推進了HIV-1疫苗在增強細胞免疫反應和誘導廣譜中和抗體兩個重要方向上的發(fā)展。
[Abstract]:Human immunodeficiency virus - 1 ( HIV - 1 ) has been widely used in the immune response of HIV - 1 vaccine . A number of HIV - 1 neutralizing antibodies with limited width and width were isolated , and the blood samples from 2005 to 2009 were studied in this paper . The monoclonal antibody DRVIA7 was isolated and isolated by monoclonal antibody amplification and expression . The specific epitope analysis was used to determine the antibody - targeted CD4 binding site ( CD4bs ) . The results show that DRVIA7 - family antibody gene has structural conflict with VRC01 antibody . In addition , it has been proved that DRVIA7 - family antibody gene has structural conflict with VRC01 antibody . It has been proved that DRVIA7 - family antibody gene has structural conflict with VRC01 antibody . It has been proved that DRVIA7 - family antibody gene has a strong ability to bind to VRC01 . In 2009 , the antibody ( Global Panel : 6.62 渭g / ml , 98 % ; DRVI Panel : 0.36渭g / ml , 98 % ; DRVI Panel : 0.36渭g / ml , 96 % ) was found . For the first time , the monoclonal broad - spectrum neutralizing antibody is isolated from the HIV - 1 infected person in China . It is proved that the key sugar level in the immune system is a hindrance to the maturation of the light chain of the antibody . On the other hand , it provides theoretical support and design thinking for the immunogen design of the antibody vaccine . On the other hand , it can induce the broad spectrum neutralization antibody for the vaccine designed to target the antibody . This study promotes the development of the HIV - 1 vaccine in enhancing the cellular immune response and inducing the broad spectrum neutralization antibody .

【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.91

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本文編號：1720429