本文關鍵詞： HIV 腦脊液 蛋白質組學 二維液相色譜 差異表達蛋白　出處：《華東師范大學》2013年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：自從1981年人類首次報道了人類獲得性免疫缺陷綜合癥以來,該病已經在全球廣泛盛行,超過20萬的人死于艾滋。HIV-1病毒不僅損壞免疫系統(tǒng),而且具有嗜神經性。從而HIV-1便成為全世界繼阿爾茨海默病和血管性癡呆后的又一主要的癡呆原因。HIV相關認知障礙是一類由HIV-1感染引起的神經系統(tǒng)疾病,是HIV-1侵犯中樞神經系統(tǒng)造成病人意識、行為和運動能力改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的綜合征。嚴重時可危及生命。HIV相關認知障礙的具體發(fā)病機制尚不清楚。目前認為,HIV或呈游離狀態(tài)或借助感染的免疫細胞跨過血腦屏障或血腦脊液屏障進入中樞神經系統(tǒng),其發(fā)病主要是由HIV病毒蛋白的毒性效應、誘導毒性細胞因子的產生和自身免疫而間接引起的。而目前有關病毒的分子生物學指標如CSF中HIV的RNA水平及相關的免疫學指標在HIV相關認知障礙的診斷和療效評估方面并無顯著的應用價值。HIV相關認知障礙在臨床實踐中顯得較為棘手,因此迫切需要篩選具有臨床應用價值的新型生物標志物。 腦脊液(cerebrospinal fluid, CSF)是存在于腦室及蛛網(wǎng)膜下腔內的一種無色透明的液體,循環(huán)流動于腦和脊髓表面,大部分由腦室脈絡叢分泌。中樞神經系統(tǒng)病變一般會導致CSF蛋白種類的改變、某些蛋白的修飾或濃度的波動。CSF與中樞神經系統(tǒng)直接聯(lián)系,反映了在不同病理條件下中樞神經系統(tǒng)的生化狀態(tài),是研究中樞神經系統(tǒng)疾病的一個獨特的窗口。 目前關于艾滋癡呆方面的蛋白質研究進展比較緩慢,而隨著蛋白質組學的飛速發(fā)展,己可以采用相關技術直接篩選具有臨床價值的的蛋白標志物。因此我們利用二維液相色譜(2D-LC)偶聯(lián)基質輔助激光解析飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術進行HIV相關認知障礙患者腦脊液差異蛋白質組學的研究,以篩選具有臨床應用價值的新型生物標志物,對HIV相關認知障礙的早期診斷、療效觀察和預后判斷等均具有明顯的現(xiàn)實意義。 1、腦脊液蛋白的二維液相色譜分離方法建立 一方面對二維液相色譜分離系統(tǒng)PF2D方法的穩(wěn)定性、可靠性進行驗證。PF2D分離系統(tǒng)具有良好的重復性和準確性,并且峰面積與蛋白濃度成正比,保證了后續(xù)分析腦脊液蛋白的可靠性。另一方面提取腦脊液的蛋白質進行初步的純化定量,進行研究。采用乙醇沉淀的方法提取腦脊液的蛋白能得到濃度為0.5-2.6mg/mL的蛋白,滿足2-DL分析1-5mg的蛋白上樣量。 2、感染HIV的腦脊液蛋白表達差異分析根據(jù)前面建立的二維液相分離方法,我們分別對感染了HIV的腦脊液和沒有感染的四種腦脊液樣品進行PF-2D的二維分離,第一維的分離中檢測器的波長設為280nm,每變化0.3個單位的pH進行收集,在pH從8.5下降到4.0的過程中收集到了16個一維組分。將每個一維組分分別進行二維分離,并用DeltVue軟件分析兩樣品中相同pH變化的二維紫外吸引圖,結果顯示有95個峰有顯著的差異,相對于對照組,HIV組有41個峰上調,有54個峰下調。再選取二維分離樣品中紫外吸收值小于0.1的峰作快速銀染檢測,結果表明檢測到了蛋白。將這些有顯著差異的色譜組分委托布魯克公司(北京)做MALDI-TOF/TOF質譜鑒定。由于該公司儀器出現(xiàn)問題,尚未給出最終結果。但從一個已鑒定出的蛋白,即白蛋白的結果看,本研究所分離得到的蛋白樣品符合質譜鑒定的要求。
[Abstract]:HIV - 1 has become a major cause of dementia following Alzheimer ' s disease and vascular dementia . HIV - 1 has become a major cause of dementia following Alzheimer ' s disease and vascular dementia . HIV - 1 has become a major cause of dementia following Alzheimer ' s disease and vascular dementia . CSF is a colorless and transparent liquid present in the ventricular and subarachnoid space , circulating on the surface of the brain and the spinal cord , most of which is secreted by the brain plexus . The central nervous system lesions generally result in changes in the type of CSF protein , the modification of certain proteins or the fluctuation of the concentration . The CSF is directly associated with the central nervous system , which reflects the biochemical status of the central nervous system under different pathological conditions , and is a unique window for the study of the central nervous system disease . Recently , with the rapid development of Proteomics , the research of differential proteomic analysis of cerebrospinal fluid in patients with HIV - related cognitive disorders was studied by using 2D - LC coupled matrix - assisted laser desorption time - of - flight mass spectrometry ( MALDI - TOF - MS ) . 1 . Two - dimensional liquid chromatography separation method for cerebrospinal fluid protein On the one hand , the stability and the reliability of the PF2D method of the two - dimensional liquid chromatography separation system are verified . The PF2D separation system has good repeatability and accuracy , and the peak area is directly proportional to the protein concentration , so that the subsequent analysis of the reliability of the cerebrospinal fluid protein is ensured . On the other hand , the protein of the cerebrospinal fluid is extracted to obtain the protein with the concentration of 0.5 - 2.6 mg / mL , and the amount of the protein on the 2 - DL analysis of 1 - 5 mg is met . 2 . The difference of the expression of cerebrospinal fluid protein in HIV infected with HIV was analyzed according to the two - dimensional liquid - phase separation method established in the preceding paragraph . The two - dimensional separation was carried out for four kinds of cerebrospinal fluid samples with HIV infection and four kinds of cerebrospinal fluid without infection . The results showed that there were significant differences in the pH value of the first dimension . The results showed that the protein was detected by MALDI - TOF / TOF mass spectrometry .

【學位授予單位】：華東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R512.91;Q75

【共引文獻】

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本文編號：1534776