本文關(guān)鍵詞： 乳香樹(shù)脂提取物 日本血吸蟲(chóng) 肝肉芽腫 肝纖維化 NF-κB　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：血吸蟲(chóng)病依然是我國(guó)亟待解決的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，該病主要死因是肝臟蟲(chóng)卵肉芽腫及其繼發(fā)的肝纖維化，血吸蟲(chóng)肝肉芽腫和纖維化是血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵分泌SEA誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的病理結(jié)果。化療對(duì)已形成的蟲(chóng)卵或纖維化已無(wú)能為力。乳香樹(shù)脂提取物（extracts of the oleogum resin from Boswellia serrate，BSE）有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，已被用于治療炎癥性結(jié)腸炎、膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎、骨性關(guān)節(jié)病等一些炎癥和免疫性疾病的臨床前期試驗(yàn)，并取得良好的效果，且副作用小。現(xiàn)有研究顯示乳香酸可以通過(guò)抑制IκB激酶（IKK）的活性而調(diào)控NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)。迄今為止，BSE對(duì)血吸蟲(chóng)肝臟肉芽腫及纖維化的治療作用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本實(shí)驗(yàn)首先觀察乳香樹(shù)脂提取物抑制血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫和纖維化的作用，再分別從細(xì)胞和分子水平初步分析了BSE對(duì)血吸蟲(chóng)肝臟肉芽腫及纖維化的治療作用機(jī)理，為控制血吸蟲(chóng)蟲(chóng)卵肉芽腫和肝纖維化提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究分為2個(gè)部分：一、乳香樹(shù)脂提取物對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟肉芽腫的抑制作用及其機(jī)制；二、乳香樹(shù)脂提取物對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟纖維化的抑制作用及其機(jī)制。 一、乳香樹(shù)脂提取物對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟肉芽腫的作用及其機(jī)制 利用20條日本血吸蟲(chóng)尾蚴感染C57/BL6小鼠制備肝蟲(chóng)卵肉芽腫動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分5組： BSE-CD（280mg/kg）組，BSE-CD（140mg/kg）組，環(huán)糊精（cyclodextrin，CD，280mg/kg）組，模型對(duì)照組（infected mice)和正常對(duì)照組（normalmice）。針對(duì)小鼠肝肉芽腫模型，我們?cè)诟腥竞?周用不同劑量的BSE或者環(huán)糊精經(jīng)腹腔注射治療，每天1次，共3周，最后一次治療后24h處死小鼠。然后檢測(cè)BSE-CD治療對(duì)感染血吸蟲(chóng)C57BL/6小鼠的肉芽腫炎癥反應(yīng)及肝臟損傷的影響。采用EMSA和免疫組化技術(shù)檢測(cè)BSE-CD治療對(duì)小鼠肝組織IKK-NF-κB信號(hào)通路的影響；RT-qPCR法分析BSE-CD治療對(duì)小鼠肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響；最后利用ELISA、RT-qPCR和Western bolt檢測(cè)BSE-CD治療對(duì)小鼠MMP-9、LTB4和PGE2的表達(dá)的影響。 結(jié)果表明：肉眼可見(jiàn)BSE-CD（280mg/kg）處理組小鼠肝臟的肉芽腫炎癥反應(yīng)明顯減輕；HE染色的肝臟病理切片顯示BSE-CD（280mg/kg）治療后，肝臟肉芽腫面積顯著小于模型對(duì)照組和環(huán)糊精組（P 0.05）；肝細(xì)胞壞死明顯減輕，血清中轉(zhuǎn)氨酶（AST/ALT）水平也相應(yīng)顯著下降（P 0.05）；而B(niǎo)SE-CD治療對(duì)感染小鼠的蟲(chóng)荷、卵荷、沒(méi)有明顯影響（P0.05）；利用磷酸化IκB激酶（IKK）抗體通過(guò)免疫組化檢測(cè)磷酸化的IKK，發(fā)現(xiàn)BSE-CD（280mg/kg）組小鼠肉芽腫周圍炎癥細(xì)胞磷酸化的IKK明顯減少（P 0.05），證實(shí)BSE-CD（280mg/kg）可抑制IKK的磷酸化；凝膠遷移遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）顯示BSE-CD（280mg/kg）治療組小鼠肝臟組織中NF-κB活性顯著下調(diào)（P 0.05）；定量PCR結(jié)果證實(shí)BSE-CD（280mg/kg）組肝組織的MCP-1、TNF-α和VEGF的mRNA水平顯著下調(diào)（P 0.05），IL-1β、IL-6的mRNA均值也低于模型對(duì)照組和環(huán)糊精組，但兩組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但BSE-CD治療對(duì)IL-13和TGF-β的mRNA水平無(wú)影響；Western bolt和定量PCR結(jié)果證實(shí)證實(shí)BSE-CD（280mg/kg）和BSE-CD（140mg/kg）治療均可顯著下調(diào)肝組織MMP-9的基因和蛋白表達(dá)水平（P 0.05）； ELISA法檢測(cè)證實(shí)BSE-CD（280mg/kg）治療可下調(diào)LTB4和PGE2的表達(dá)（P 0.05）。 總之，BSE-CD早期干預(yù)可以減輕血吸蟲(chóng)感染小鼠的急性期肝臟肉芽腫病變，減輕肝細(xì)胞壞死，同時(shí)伴有抑制NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)，下調(diào)肝組織MCP-1、TNF-α和VEGF的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)BSE-CD治療可下調(diào)MMP-9、LTB4和PGE2的表達(dá)。故BSE-CD抑制肝肉芽腫的機(jī)制之一是通過(guò)抑制IKK的活性而下調(diào)NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)，下調(diào)MCP-1、TNF-α和VEGF的表達(dá)；同時(shí)還與BSE-CD抑制一些生化介質(zhì)，如MMP-9、LTB4和PGE2的表達(dá)相關(guān)。 二、乳香樹(shù)脂提取物對(duì)日本血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟纖維化的作用及其機(jī)制 利用血吸蟲(chóng)尾蚴感染C57/BL6小鼠制備肝纖維化模型，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物共分5組：BSE-CD（280mg/kg）組，BSE-CD（140mg/kg）組，環(huán)糊精（cyclodextrin，CD，280mg/kg）組，，模型對(duì)照組（infected mice)和正常對(duì)照組（normal mice）。針對(duì)小鼠肝纖維化模型，并于感染后42天經(jīng)胃灌吡喹酮(500mg/kg/d x2d），在感染后7周用同不同劑量的BSE或者環(huán)糊精經(jīng)腹腔注射治療，每天1次，共治療21天，最后一次治療后24h處死小鼠。肝臟組織切片Masson染色檢測(cè)BSE-CD對(duì)感染血吸蟲(chóng)C57BL/6小鼠治療后對(duì)肝纖維化的影響；檢測(cè)血清肝纖維化指標(biāo)透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）和層粘連蛋白（laminin，LN）LN；采用免疫組化檢測(cè)BSE-CD治療對(duì)小鼠肝組織α-SMA的影響；RT-qPCR法分析BSE-CD治療對(duì)小鼠肝組織炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響。體外培養(yǎng)肝星狀細(xì)胞（hepatic stellatecells，HSC）-T6，采用MTT法檢測(cè)BSE-CD對(duì)的HSC-T6增殖作用，Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BSE-CD對(duì)活化HSC-T6凋亡形態(tài)和凋亡率的影響。 結(jié)果表明：Masson染色證實(shí)BSE-CD（280mg/kg）治療組肝臟纖維化的面積明顯減少（P 0.05）；BSE-CD（280mg/kg）治療對(duì)血清中HA和LN沒(méi)有影響（(P0.05）；免疫組織化學(xué)結(jié)果提示：BSE-CD（280mg/kg）組小鼠肝臟α-SMA表達(dá)面積較模型對(duì)照組和環(huán)糊精組下降32.3%（P 0.05）；定量PCR結(jié)果證實(shí)BSE-CD（280mg/kg）組肝組織的MCP-1、TNF-α和VEGF mRNA水平顯著下調(diào)（P 0.05），IL-1β、IL-6的mRNA均值也低于模型對(duì)照組和環(huán)糊精組，但兩組之間的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但BSE-CD治療對(duì)IL-13和TGF-β的mRNA水平無(wú)影響。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BSE-CD（0.25-0.2mg/ml）能顯著抑制HSC-T6細(xì)胞的增殖，并呈一定的量效關(guān)系； Hoechst33258染色和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)BSE-CD （0.25-0.2mg/ml）作用HSC-T648h能誘導(dǎo)HSC-T6凋亡，同對(duì)照組相比，凋亡率顯著增加（P 0.05）。 總之，BSE-CD晚期治療可以緩解血吸蟲(chóng)感染小鼠肝臟纖維化病變，同時(shí)伴有下調(diào)肝組織MCP-1、TNF-α和VEGF的表達(dá)；體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BSE可抑制HSC的增殖和誘導(dǎo)HSC凋亡。故BSE-CD抑制肝纖維化的機(jī)制之一是通過(guò)下調(diào)NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)，下調(diào)MCP-1、TNF-α和VEGF的表達(dá)，減輕對(duì)HSC的激活。BSE對(duì)肝纖維化的治療作用機(jī)制還與其抑制HSC的增殖和誘導(dǎo)活化的HSC凋亡相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R532.21;R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1528562