本文關鍵詞： 白色念珠菌 拉曼光譜 動態(tài)表面增強拉曼光譜 真菌診斷 藥物篩選　出處：《第二軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：近年來,抗真菌藥物的大量濫用導致了真菌的耐藥現(xiàn)象越來越嚴重,各類真菌普遍存在耐藥性己經成為臨床抗真菌治療失敗的主要原因。其中,耐藥白色念珠菌引起的感染直接威脅感染者的生命。傳統(tǒng)的細胞生物學方法包括酶聯(lián)免疫組化,分子生物學,藥敏試驗等,需要復雜的樣品前處理,存在耗時長,成本高等缺點,無法快速準確地對耐藥白念珠菌進行早期診斷,從而耽誤了治療。拉曼光譜,尤其是表面增強拉曼光譜技術,具備快速、實時、無損的特點,在很多領域應用廣泛。同時,不受水分干擾、熒光淬滅、特征性強等優(yōu)勢使其非常適合用于生物體系的研究。因此,我們嘗試將表面增強拉曼光譜應用于耐藥真菌的診斷以及抗菌藥物的篩選。本文將針對以下三個方面開展研究,以期進一步完善表面增強拉曼光譜法及其應用,并為真菌診斷和藥物篩選提供新策略和新方法。1.動態(tài)表面增強拉曼光譜法的建立及參數(shù)考察表面增強拉曼光譜法(SERS)是一種快速、實時、無損的檢測方法,由于其不受水干擾,因此十分適合生物樣品的研究。但是目前的細胞檢測手段仍存在一些問題。制備適應特定生物細胞的SERS基底需耗費大量的人力物力,普及性較差。而采用制備簡單的廣泛使用的SERS基底納米溶膠,則存在靈敏度較低、重現(xiàn)性較差、激光對生物樣品造成破壞且檢測前等待時間較長的問題。本章針對后者對其進行了改進,即引入動態(tài)表面增強拉曼光譜法(D-SERS)。該法無需制備復雜的特異性基底,同時具備高靈敏、高重現(xiàn)性、水作為生物樣品的保護溶劑且在檢測前無需等待菌膠混合的大量時間等優(yōu)點,很好解決了傳統(tǒng)表面增強拉曼光譜法中存在的問題。本研究制備了3類SERS增強基底,詳細表征了各類SERS基底的結構和特征。同時也考察了基底對白念珠菌的活性影響,綜合比較基底對細胞的活性影響與增強效果最終優(yōu)選出最佳的增強基底接下來本章詳細介紹了D-SERS的原理,并利用工具菌與優(yōu)選的SERS基底及對方法學指標包括靈敏度、穩(wěn)定性及重現(xiàn)性進行了考察,同時也進行了詳細的真菌光譜峰歸屬分析。2.動態(tài)表面增強拉曼光譜法用于耐藥白色念珠菌的診斷研究常規(guī)診斷耐藥白色念珠菌的方法為藥敏實驗。作為金標準方法,該法確實準確性好,但耗時較長通常為24h。這顯然無法滿足日益增長的真菌感染的診治需求。如果能夠快速準確的診斷出耐藥菌,這無疑具有很大的臨床意義。本章采用具有快速、指紋圖譜特征的D-SERS法用于鑒別耐藥白色念珠菌,并同時以相應的敏感菌株作為參照(二者在外觀形態(tài)幾乎無差別)。此外,我們對采集的SERS光譜進行了2種信息處理方法:峰比值法及化學計量學法。峰比值法幫助我們找出了區(qū)分兩類菌株差異的光譜區(qū)域。化學計量學法即PLS-DA建立了敏感和耐藥菌株的分類模型,以較高的準確度區(qū)分了二者并進行了未知菌株的預測。結果表明兩種方法均可達到快速準確的診斷耐藥真菌的目的。3.D-SERS法用于不同機理的抗真菌藥的分類研究通常用于真菌治療的藥物篩選方法為藥敏實驗。該方法存在耗時較長的缺點,同樣無法滿足日益增長的真菌感染的診療需求。如果在較短時間內判斷出某抗菌藥的治療效果,這必定對臨床用藥具有很大的意義。本章中利用D-SERS法快速地對不同機理的抗菌藥進行了分類,并同時與各類抗菌藥的抗菌機理一一對應。我們還利用PLS-DA法建立的模型以及留一法進行了未知藥物機理的預測。通過對上述藥物的快速篩選,我們發(fā)現(xiàn)棘白菌素類藥物具有很好的抗菌活性。此外,雖然文獻表明納米銀由于無耐藥性,具有良好的抗菌活性,但也會隨著各種因素的變化發(fā)生抗菌效果的改變。如果納米銀與菌細胞表面電荷存在靜電排斥,這將降低納米銀的抗菌效率。制備與菌細胞相反電荷的納米溶膠比較復雜,而急性毒性的納米銀雖然可以克服電荷壁壘起到較好的抗菌效果,但過多的釋放也會對人體造成相應的細胞損傷。因此,如果將亞急性毒性的納米銀和高選擇性的棘白菌素類抗真菌藥聯(lián)合使用,必將起到良好的抗菌效果。本章中將棘白菌素類藥物和亞急性毒性納米銀與白色念珠菌共孵育,同時以聯(lián)合用藥后的D-SERS光譜的變化對該過程進行監(jiān)測。研究發(fā)現(xiàn)高濃度的棘白菌素類藥物聯(lián)合亞急性毒性納米銀能夠達到與單獨急性納米銀相當?shù)目咕Ч?br/>[Abstract]:Surface - enhanced Raman spectroscopy ( SERS ) is a fast , real - time and nondestructive testing method . In this chapter , we use the D - SERS method to classify the antifungal drugs with different mechanisms .

【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：O657.37;R519.3

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本文編號：1520362