本文關(guān)鍵詞： 鼠疫耶爾森氏菌 aspA基因 生存能力 毒力 適應(yīng)度　出處：《中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis,以下簡(jiǎn)稱鼠疫菌)引起的一種暴發(fā)性的烈性傳染病。人類跟鼠疫之間存在一個(gè)長(zhǎng)期的斗爭(zhēng)過程,到目前為止,鼠疫仍然是公共衛(wèi)生領(lǐng)域的一個(gè)重大的威脅,每年國(guó)際上都會(huì)出現(xiàn)疫情暴發(fā)并致人死亡。傳統(tǒng)的微生物學(xué)、基因組學(xué)以及細(xì)菌群體遺傳學(xué)都表明鼠疫菌是在約2600-5000年前由假結(jié)核耶爾森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis,簡(jiǎn)稱假結(jié)核菌)進(jìn)化而來。由于遺傳分化時(shí)間非常短暫,鼠疫菌跟其祖先菌株假結(jié)核菌同時(shí)存在,我們能夠通過比較基因組學(xué)和功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)的方式來研究鼠疫菌這種致命的病原菌是如何進(jìn)化而來的。假結(jié)核菌是一種腸道病原菌,其可以在土壤環(huán)境或者水環(huán)境等自然環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間生存,僅會(huì)引起慢性腸道疾病。與假結(jié)核菌不同,鼠疫菌具有更強(qiáng)的侵襲能力和致病能力,但其通常只能在哺乳動(dòng)物和跳蚤之間的狹小宿主范圍內(nèi)傳遞。鼠疫菌和假結(jié)核菌在傳播途徑、致病能力和生存環(huán)境上存在著巨大的差異,而二者90%以上的基因都是相同或者幾乎相同的。鼠疫菌和假結(jié)核菌的基因組比較結(jié)果顯示,鼠疫菌獲得了兩個(gè)外源性的質(zhì)粒(p MT1和p PCP1),同時(shí)約有13%的假結(jié)核菌基因在鼠疫菌中失去了活性。在這些失活基因中,編碼天門冬氨酸酶的asp A基因是很獨(dú)特的。天門冬氨酸酶(Asp A)催化一個(gè)可逆反應(yīng)(天門冬氨酸生成延胡索酸并釋放一個(gè)氨基)。我們前期對(duì)于鼠疫菌基因組的研究發(fā)現(xiàn),asp A基因第363位密碼子是鼠疫菌進(jìn)化中的一個(gè)突變熱點(diǎn)。為了進(jìn)一步檢驗(yàn)asp A基因第363位密碼子的多樣性,我們對(duì)來自我國(guó)14個(gè)不同疫源地不同分離時(shí)間(1943年至2005年期間)的819株鼠疫菌進(jìn)行了asp A基因測(cè)序,確定了asp A基因第363位密碼子至少9種等位基因型的存在。進(jìn)一步的信息學(xué)分析顯示這些突變并不是進(jìn)化譜系(lineage)特異性的,而且同一種突變?cè)谑笠呔倪M(jìn)化過程中多次出現(xiàn)。鼠疫菌asp A基因第363位密碼子的高突變頻率以及這些等位基因型的趨同進(jìn)化表明,該密碼子的突變可能是經(jīng)過多樣化的正向選擇壓力篩選形成的。在典型鼠疫菌群體中,asp A基因第363位密碼子的主要等位基因型是TTG,其編碼的天門冬氨酸酶功能失活。但是在假結(jié)核菌和一些古老的鼠疫菌中,asp A基因第363位密碼子是GTG,其編碼了一個(gè)功能正常的天門冬氨酸酶。根據(jù)上述的結(jié)果我們提出假設(shè),asp A基因第363位密碼子的高頻率突變是趨向于恢復(fù)鼠疫菌中天門冬氨酸酶的活性。為了驗(yàn)證這一推論,我們需要在鼠疫菌asp A基因的第363位密碼子處引入不同的突變并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些突變對(duì)鼠疫菌生存和繁殖帶來的影響。鼠疫菌201菌株根據(jù)鼠疫菌的生物型分類,屬于田鼠型菌株,其asp A基因第363位密碼子為GTG,與假結(jié)核菌中的asp A基因一致,其編碼的天門冬氨酸酶是有活性的。我們基于λ-Red重組系統(tǒng)在鼠疫菌中建立了一個(gè)無痕突變技術(shù)平臺(tái),并成功構(gòu)建了兩株鼠疫菌201菌株asp A基因第363位密碼子突變株,其中一株將asp A基因第363位密碼子由GTG突變?yōu)門TG(201-asp ATTG),導(dǎo)致了其編碼天門冬氨酸酶的失活;另一株將密碼子由GTG突變?yōu)門TT(201-asp ATTT),其編碼天門冬氨酸酶活性降低至野生型10%左右。隨后我們比較了鼠疫菌201野生株和突變株之間的表型差異。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn),asp A基因第363位密碼子的突變對(duì)201株的生長(zhǎng)和抵抗外界環(huán)境脅迫能力造成了明顯的影響。與201野生株和突變株201-asp ATTT相比,突變株201-asp ATTG在豐富培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)或者營(yíng)養(yǎng)缺乏培養(yǎng)基(TMH培養(yǎng)基)中的生長(zhǎng)均存在一定程度的遲滯。當(dāng)去除掉TMH培養(yǎng)基中的L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-天冬酰胺和L-谷氨酰胺等Asp A代謝相關(guān)的氨基酸后,201菌株野生株和突變株201-asp ATTT以及201-asp ATTG的生長(zhǎng)狀態(tài)趨于一致,證明這種生長(zhǎng)差距確實(shí)是由asp A基因的突變引起的。進(jìn)一步的抗外界環(huán)境脅迫能力實(shí)驗(yàn)顯示,201野生株和突變株201-asp ATTT的抗氧化能力和耐酸能力均要優(yōu)于突變株201-asp ATTG。這些體外模擬刺激條件都與巨噬細(xì)胞內(nèi)的微環(huán)境吻合,提示我們asp A基因的多樣性可能與鼠疫菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖能力相關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這個(gè)猜想:與201菌株野生株相比,突變株201-asp ATTT和201-asp ATTG的抗吞噬能力沒有差異,但是二者在RAW264.7巨噬細(xì)胞中的生存和增殖能力均出現(xiàn)了缺陷。而鼠疫菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和增殖能力,對(duì)于鼠疫菌早期感染是至關(guān)重要的。為了比較201野生株和兩株突變株之間的毒力差異,我們用BALB/c小鼠進(jìn)行了腹股溝皮下注射攻毒,繪制了小鼠生存曲線,并測(cè)量了突變株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量(LD50)。結(jié)果顯示,突變株201-asp ATTT和201-asp ATTG均出現(xiàn)了不同程度的減毒,突變株201-asp ATTT對(duì)BALB/c小鼠的半數(shù)致死量為5.75×105CFU,突變株201-asp ATTG的減毒程度更高,3.69×106CFU的攻毒劑量都無法造成小鼠的死亡,而201野生株對(duì)BALB/c小鼠的半數(shù)致死量小于10CFU。這一系列毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們,asp A基因第363位密碼子的突變與鼠疫菌的毒力有著密切的關(guān)系。最后我們進(jìn)行了一個(gè)體外培養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn),將201菌株野生株和突變株201-asp ATTG按照一定的比例混合后,在豐富培養(yǎng)基(LB)中共培養(yǎng),隨后提取混合DNA并對(duì)Asp A基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序。通過高通量測(cè)序分析,我們發(fā)現(xiàn)201菌株野生株(Asp A有活性)能夠在生長(zhǎng)的過程中很快的超越突變株201-asp ATTG(Asp A失活),在群體中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。這一結(jié)果說明在鼠疫菌中,含有asp A活性基因的菌株具有適應(yīng)度優(yōu)勢(shì),asp A基因第363位密碼子承受了正選擇壓力而趨于恢復(fù)典型鼠疫菌中失活asp A基因的活性。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,細(xì)菌中特定基因的單一密碼子也可以成為自然選擇的作用對(duì)象。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R516.8

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