發(fā)布時間：2017-11-23 17:18

  本文關(guān)鍵詞：多重微球芯片技術(shù)應(yīng)用于病毒性疾病診斷的研究

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【摘要】：美國Luminex公司近年來開發(fā)了一種高通量檢測技術(shù)——多重微球芯片技術(shù)(Multiple·Bead·Array·Assays),它是以熒光編碼的微球為載體,整合應(yīng)用流體學、激光分析、高速數(shù)字信號處理、計算機運算法則等多項技術(shù)的多重檢測分析平臺,其最大的特點是可實現(xiàn)最多同時快速檢測100種指標,且檢測目標物涵蓋了抗體、核酸、細胞因子等多種生物分子,被國際業(yè)界專家評價為臨床診斷的趨勢性技術(shù)之一。本研究的主要目的是將多重微球芯片技術(shù)應(yīng)用于病毒性疾病的診斷研究,以進一步完善病毒性疾病實驗室的診斷方法。研究的第一部分通過應(yīng)用該技術(shù)建立起快速、靈敏、高通量的病毒性出血熱疾病的實驗室檢測方法,以期對我國常見病毒性出血熱臨床樣本進行快速篩查和診斷。方法是將表達純化的十三種出血熱病毒的重組蛋白分別偶聯(lián)至熒光微球,通過對相應(yīng)多克隆兔血清的單重檢測來評價抗原偶聯(lián)效果,再用偶聯(lián)好的13重熒光微球先分別檢測96份正常人血清的Ig M和Ig G抗體來確定該多重血清學檢測方法的cutoff值,為評價該方法對我國常見病毒性出血熱疾病的檢測效果,分別檢測了已通過RT-PCR或ELISA方法確診為陽性血清的71份HFRS病人急性期血清和73份HFRS病人恢復期血清、各41份SFTS病人急性期和恢復期血清、50份DENGUE病人急性期血清和64份DENGUE病人恢復期血清。對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析顯示,本研究建立的針對我國常見三大病毒性出血熱的13重微球芯片檢測方法具有高靈敏度和特異度,不管是對急性期血清還是恢復期血清的檢測,皆與金標準的符合率高,且Kappa值均大于或等于0.75,一致性程度很好。應(yīng)用多重微球芯片技術(shù)建立針對我國常見病毒性出血熱診斷方法的初步成功,使得快速、靈敏、高通量的病毒性出血熱疾病實驗室檢測方法或成為可能。與此同時,我們也正嘗試將這一技術(shù)應(yīng)用于另一類病毒性疾病——腸道病毒引起的手足口病的檢測工作。EV71是導致手足口病的重要病原體,在應(yīng)用多重微球芯片技術(shù)檢測血清的方法研究中,前期病毒蛋白抗原的表達、純化和鑒定至關(guān)重要,所以在本研究的后半部分,我們利用原核表達菌大腸桿菌BL21(DE3)對EV71-VP1蛋白進行表達及純化,同時對重組表達蛋白的抗原活性進行鑒定。EV71-VP1蛋白的表達是通過提取病毒RNA,擴增含VP1全長基因片段;經(jīng)TA克隆、測序證實序列無誤后,設(shè)計引物擴增完整的病毒VP1基因并克隆至p ET32a(+)表達載體上,構(gòu)建的重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到原核表達菌大腸桿菌BL21(DE3)中進行誘導表達,表達產(chǎn)物的含量和抗原活性采用SDS-PAGE、Western Blot等試驗鑒定。本研究結(jié)果顯示構(gòu)建的p ET32a/LY008-VP1重組質(zhì)粒經(jīng)誘導后可表達VP1蛋白,重組蛋白的分子量符合預(yù)期,Western Blot證實具有強抗原活性。至此,在本次將多重微球芯片技術(shù)應(yīng)用于病毒性疾病的研究中,我們主要完成了將其應(yīng)用于我國病毒性出血熱診斷的研究部分,同時我們建立起本實驗室的全套蛋白表達系統(tǒng),為接下來其他重要腸道病毒蛋白的表達提供了技術(shù)思路,也給建立基于多重微球芯片技術(shù)平臺的快速、靈敏、高通量的手足口病或其他病毒性疾病實驗室檢測方法做好了前期準備。此外,表達的VP1重組蛋白也可以進一步研究用于EV71血清流行病學調(diào)查的開展以及為抗EV71單克隆抗體的研究、研發(fā)針對EV71感染的疫苗或構(gòu)建EV71感染的早期快速診斷試劑等奠定了重要基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R511;R440

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本文編號：1219230