本文關(guān)鍵詞：人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其病毒包裝鑒定

  更多相關(guān)文章： 宮頸癌 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 小發(fā)卡RNA 慢病毒載體 Caski細(xì)胞

【摘要】：目的:構(gòu)建攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)慢病毒表達(dá)載體LV3-shRNA-hTERT及其病毒包裝鑒定并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染宮頸癌Caski細(xì)胞系。方法:使用Designer3.0(Genepharma)軟件設(shè)計(jì)靶向hTERT的小發(fā)卡RNA(shRNA)序列,將hTERT-shRNA基因片段插入慢病毒載體pGLV3/H1/GFP+Puro中,構(gòu)建慢病毒表達(dá)質(zhì)粒LV3-shRNA-hTERT。通過酶切、DNA測(cè)序驗(yàn)證hTERT片段的準(zhǔn)確性,將LV3-shRNA-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,濃縮上清并測(cè)定病毒滴度獲得重組慢病毒,將該重組慢病毒感染Caski細(xì)胞,通過觀測(cè)綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)判斷轉(zhuǎn)染成功與否以及估計(jì)轉(zhuǎn)染效率,RTPCR、Western blot分別測(cè)定轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的hTERTmRNA水平和hTERT蛋白表達(dá)情況,TRAP-ELISA法測(cè)定細(xì)胞端粒酶活性。結(jié)果:LV3-shRNA-hTERT攜帶正確hTERT基因,重組病毒經(jīng)PCR證實(shí)hTERT-shRNA基因插入。利用重組慢病毒介導(dǎo)將重組質(zhì)粒LV3-shRNA-hTERT高效轉(zhuǎn)導(dǎo)入宮頸癌Caski細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá),熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后24 h Caski細(xì)胞即開始發(fā)出綠色熒光,72 h后有大量熒光表達(dá),而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Caski細(xì)胞中不表達(dá)。檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的Caski細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)有3條鏈能明顯抑制hTERT mRNA和蛋白水平的表達(dá),并顯著降低了細(xì)胞端粒酶活性,其中以72H-TERT-1515抑制作用最強(qiáng),對(duì)hTERTmRNA和蛋白的抑制率分別達(dá)75.0%和70.3%,端粒酶活性下降74.6%。結(jié)論:成功構(gòu)建攜帶hTERT-shRNA慢病毒表達(dá)載體LV3-shRNA-hTERT,并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Caski細(xì)胞系,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的shRNA能有效抑制宮頸癌Caski細(xì)胞hTERT mRNA水平和hTERT蛋白表達(dá),并顯著降低細(xì)胞端粒酶活性。為端粒酶在宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究、宮頸癌基因治療的體外干擾治療奠定了工作基礎(chǔ)。
【作者單位】： 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科;廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所;
【關(guān)鍵詞】： 宮頸癌 人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因 小發(fā)卡RNA 慢病毒載體 Caski細(xì)胞
【基金】：廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目〔2013GXNSFAA019254〕 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題〔Z2013013〕 廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目〔YCBZ2013015〕
【分類號(hào)】：R393
【正文快照】： 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一,是女性生殖系統(tǒng)第二大腫瘤。雖然宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,但目前已獲得公認(rèn)的是高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)感染是發(fā)生宮頸癌的必要因素。宿主細(xì)胞感染后,HR-HPV E6蛋白能誘發(fā)端粒改變及端粒酶激活,而端粒酶異常表達(dá)可使細(xì)胞逃避衰老、

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9 段群軍;應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制人巨細(xì)胞病毒UL122、UL54基因體外表達(dá)的研究[D];浙江大學(xué);2010年

10 張銳;穩(wěn)定表達(dá)靶向HSV2 VP16 shRNA重組細(xì)胞系的建立及其對(duì)HSV2復(fù)制能力影響研究[D];鄭州大學(xué);2012年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 馬貴亮;慢病毒載體介導(dǎo)的TNF-α基因在臍血間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[D];青島大學(xué);2010年

2 欒沖;可誘導(dǎo)表達(dá)hBMP-2基因的慢病毒載體的構(gòu)建及其慢病毒的產(chǎn)生和鑒定[D];青島大學(xué);2010年

3 陳春;攜帶大鼠Foxp3基因慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒包裝的研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

4 劉偉;小鼠趨化因子MIP-1α和共刺激分子B7-1基因重組慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定[D];福建醫(yī)科大學(xué);2011年

5 姚志芳;人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS）系的建立[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

6 智深深;Islet-1在C_3H_(10)T1/2細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞特異性分化過程中的作用研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

7 陳新磊;選擇性下調(diào)大鼠ACC神經(jīng)元NR2B受體表達(dá)的小RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建[D];山東大學(xué);2010年

8 李偉;大鼠CRX基因的重組慢病毒載體LV-Rho-EGFP/CRX的構(gòu)建和表達(dá)[D];中南大學(xué);2008年

9 林長(zhǎng)貴;慢病毒載體介導(dǎo)nanog基因修飾小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[D];福建醫(yī)科大學(xué);2008年

10 薛美思;攜帶重組人胰島素基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2010年

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