本文關(guān)鍵詞：骨橋蛋白對間充質(zhì)干細(xì)胞運動能力及其核力學(xué)性質(zhì)的影響

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 骨橋蛋白 細(xì)胞運動 細(xì)胞核硬度 核纖層蛋白A/C

【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一種中胚層來源的成體干細(xì)胞,在適宜的條件下可分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、成骨細(xì)胞以及成脂肪細(xì)胞等中胚層或其他非中胚層來源的細(xì)胞。MSCs分布廣泛,在骨髓、牙髓、脂肪、外周血中都能夠分離出來。在組織損傷修復(fù)中,損傷部位可分泌一些趨化因子,誘導(dǎo)MSCs定向遷移到損傷部位,并通過增殖、分化、分泌抗炎因子等方式促進(jìn)組織修復(fù)。因為MSCs具有來源廣泛、易于培養(yǎng)、免疫原性較弱、具有分化潛能以及不涉及倫理道德問題等特點,因此具有巨大的臨床運用前景,其在組織損傷修復(fù)上的作用及機(jī)理已成為近年來的研究熱點。骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種廣泛存在的基質(zhì)蛋白和細(xì)胞因子,在干細(xì)胞壁龕(Niche)的維持、細(xì)胞的遷移與侵襲、癌細(xì)胞干性的維持、癌細(xì)胞凋亡的抑制及干細(xì)胞歸巢等生理過程起非常關(guān)鍵的作用。研究表明,MSCs可響應(yīng)損傷部位分泌的OPN發(fā)生定向運動,因此研究OPN影響MSCs運動能力的規(guī)律及其機(jī)理有助于揭示MSCs參與組織損傷修復(fù)的調(diào)控機(jī)制。細(xì)胞的運動在胚胎發(fā)生、傷口愈合、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移等生理過程中起關(guān)鍵的作用,其與細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞-基質(zhì)粘附、細(xì)胞以及細(xì)胞核力學(xué)性質(zhì)有關(guān),其中細(xì)胞核的硬度、變形性等力學(xué)性質(zhì)決定了3D模型中細(xì)胞運動速度和效率。細(xì)胞的侵襲是依賴基質(zhì)纖維水解的運動方式,其中有基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)的參與。包括OPN在內(nèi)的多種生化因子可通過一定的信號通路影響MMPs的表達(dá),從而影響細(xì)胞的侵襲。盡管細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)制以及作用的理論比較透徹,但這方面的實驗研究主要集中在癌細(xì)胞上,目前對MSCs的運動能力相關(guān)機(jī)理的研究還不是十分充分。鑒于MSCs運動能力和OPN存在廣泛聯(lián)系,且MSCs具有巨大的干細(xì)胞醫(yī)療運用前景,本文從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞核力學(xué)特征兩方面探討OPN影響MSCs運動能力的機(jī)制,以期為推動MSCs的臨床應(yīng)用提供研究數(shù)據(jù)參考。本文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:1.MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定本文采用差時貼壁法分離培養(yǎng)大鼠MSCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn),所得的細(xì)胞個體形狀大致呈長梭形,折光率高;群體形態(tài)呈漩渦形。采用流式細(xì)胞術(shù)分析表面抗原表達(dá)情況,結(jié)果表明,培養(yǎng)分離的細(xì)胞表達(dá)CD90、CD44,而不表達(dá)CD34。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和流式細(xì)胞術(shù)分析檢測結(jié)果提示,所得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的一般特征。2.OPN對MSCs運動能力的影響本文采用transwell小室法檢測OPN對MSCs運動能力的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),OPN作用下MSCs沒有明顯的增殖現(xiàn)象,但是其遷移和基質(zhì)膠侵襲能力卻顯著加強(qiáng),提示OPN可以增強(qiáng)MSCs的運動能力。Western blot檢測結(jié)果顯示,OPN處理能夠有效提高FAK和ERK1/2分子的磷酸化水平,而FAK抑制劑PF573228或ERK1/2抑制劑PD98059處理均能有效下調(diào)OPN誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲,提示OPN通過激活FAK和ERK1/2促進(jìn)MSCs的遷移和侵襲。使用明膠酶譜實驗檢測MMPs活力發(fā)現(xiàn),OPN可顯著增強(qiáng)MMP2活性,但對MMP9的活力沒有顯著影響;另外,PD98059和PF573228處理能下調(diào)OPN誘導(dǎo)的MMP2活性,提示OPN可能通過FAK、ERK1/2影響MMP2的活性,進(jìn)而影響MSCs的侵襲。3.OPN對MSCs細(xì)胞核力學(xué)特征的影響為了驗證細(xì)胞核力學(xué)特征變化在OPN誘導(dǎo)的細(xì)胞運動能力中是否有作用,本文使用原子力顯微鏡(Atomic force microscope,AFM)檢測細(xì)胞核硬度變化,結(jié)果表明,OPN處理能夠有效地降低MSCs細(xì)胞核的楊氏模量。使用PD98059或PF573228處理MSCs能顯著恢復(fù)OPN誘導(dǎo)的細(xì)胞核硬度降低,提示FAK和ERK1/2介導(dǎo)了OPN對細(xì)胞核硬度的調(diào)節(jié)。細(xì)胞核骨架蛋白LaminA/C是影響細(xì)胞核硬度的主要因素。使用RT-PCR和Western blot檢測OPN對laminA/C蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果表明OPN的處理無論在mRNA水平上還是在蛋白質(zhì)水平上都能顯著降低LaminA/C的表達(dá)。進(jìn)一步使用PD98059或PF573228處理細(xì)胞以阻斷ERK1/2或FAK的磷酸化激活發(fā)現(xiàn),兩者均能夠增加OPN降低的LaminA/C表達(dá)。這些實驗結(jié)果表明,OPN通過FAK和ERK1/2降低LaminA/C表達(dá),而LaminA/C的下調(diào)有可能是細(xì)胞核楊氏模量變化的原因。綜上所述,本文研究結(jié)果表明,OPN通過FAK、ERK1/2影響MSCs的遷移,通過FAK、ERK1/2和MMP2影響MSCs的侵襲,并且OPN可能通過FAK、ERK1/2降低LaminA/C表達(dá),降低MSCs細(xì)胞核硬度,從而提高M(jìn)SCs的運動能力。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 骨橋蛋白 細(xì)胞運動 細(xì)胞核硬度 核纖層蛋白A/C
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 1 緒論11-18
• 1.1 研究背景11-16
• 1.1.1 骨橋蛋白的結(jié)構(gòu)和功能11-12
• 1.1.2 OPN的受體12-13
• 1.1.3 MSCs和組織損傷修復(fù)的關(guān)系13-14
• 1.1.4 OPN與細(xì)胞運動能力14-15
• 1.1.5 細(xì)胞運動和細(xì)胞核的關(guān)系15-16
• 1.2 本文所關(guān)心的內(nèi)容16
• 1.3 研究內(nèi)容及其意義16-17
• 1.3.1 研究內(nèi)容16
• 1.3.2 研究意義16-17
• 1.4 技術(shù)路線17-18
• 2 MSCs的分離、鑒定和培養(yǎng)18-23
• 2.1 引言18
• 2.2 實驗材料18-19
• 2.2.1 主要儀器耗材18
• 2.2.2 實驗試劑與藥品18-19
• 2.2.3 實驗動物19
• 2.2.4 主要實驗試劑的配制19
• 2.3 實驗方法19-20
• 2.3.1 MSCs原代分離和培養(yǎng)19
• 2.3.2 MSCs傳代培養(yǎng)19
• 2.3.3 MSCs表面抗原分析19-20
• 2.4 實驗結(jié)果20-21
• 2.4.1 MSCs的形態(tài)學(xué)觀察20-21
• 2.4.2 MSCs表面抗原表達(dá)情況21
• 2.5 討論21-22
• 2.6 本章小結(jié)22-23
• 3 OPN通過FAK、ERK1/2 提高M(jìn)SCs的運動能力23-38
• 3.1 引言23
• 3.2 實驗材料23-27
• 3.2.1 儀器耗材23-24
• 3.2.2 藥品與試劑24-25
• 3.2.3 主要試劑配制25-27
• 3.3 實驗方法27-30
• 3.3.1 細(xì)胞計數(shù)法檢測細(xì)胞增殖27
• 3.3.2 Transwell小室檢測MSCs的遷移和侵襲27-28
• 3.3.3 明膠酶譜法檢測MSCs MMP2和MMP9的活性28-29
• 3.3.4 Western blot29-30
• 3.4 實驗結(jié)果30-35
• 3.4.1 OPN處理不影響MSCs的增殖30-31
• 3.4.2 OPN促進(jìn)MSCs遷移和侵襲31-32
• 3.4.3 OPN促進(jìn)MSCs中FAK、ERK1/2 的磷酸化32-33
• 3.4.4 FAK、ERK1/2 磷酸化介導(dǎo)OPN誘導(dǎo)的MSCs遷移和侵襲33-34
• 3.4.5 OPN通過FAK、ERK1/2 影響MMP2活力34-35
• 3.5 討論35-37
• 3.6 本章小結(jié)37-38
• 4 OPN通過FAK、ERK1/2 影響MSCs細(xì)胞核力學(xué)性質(zhì)38-48
• 4.1 引言38
• 4.2 實驗材料38-40
• 4.2.1 主要儀器與耗材38-39
• 4.2.2 主要實驗藥品與試劑39
• 4.2.3 主要試劑配制39-40
• 4.3 實驗方法40-43
• 4.3.1 原子力顯微鏡檢測細(xì)胞核硬度變化40-41
• 4.3.2 RT-PCR41-42
• 4.3.3 Western blot42-43
• 4.4 實驗結(jié)果43-46
• 4.4.1 OPN通過FAK、ERK1/2 影響細(xì)胞核楊氏模量43-44
• 4.4.2 OPN影響MSCs LaminA/C表達(dá)44-45
• 4.4.3 FAK、ERK1/2 介導(dǎo)OPN對細(xì)胞核LaminA/C的下調(diào)作用45-46
• 4.5 討論46-47
• 4.6 本章小結(jié)47-48
• 5 結(jié)論與展望48-49
• 5.1 主要結(jié)論48
• 5.2 后續(xù)研究工作的展望48-49
• 致謝49-50
• 參考文獻(xiàn)50-57
• 附錄A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄57

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本文編號：826630