本文關鍵詞：靶向Group2流感病毒血凝素莖部的廣譜反應性抗體篩選與研究

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【摘要】：流感病毒是抗原性高度變異的病毒,尤其是甲型流感病毒,具有更廣泛的宿主及高度變異性,根據病毒血凝素(hemagglutinin, HA)和神經氨酸酶(neuraminidase, NA),甲型流感病毒分為18個HA亞型(H1-H18)和11個NA亞型(N1-N11),18個HA亞型包括兩個組(Group),即Group1 (H1、H2、 H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17和H18)和Group2 (H3、H4、 H7、H10、H14和H15)。HA是病毒表面主要抗原,由高度變異的頭部和相對保守的莖部[Cys52-Cys277 (H3序號)]組成。目前預防流感病毒的主要措施是疫苗接種,疫苗組份包括甲型流感病毒(H1N1和H3N2亞型)和一個或兩個乙型流感病毒株,疫苗主要誘導機體產生針對HA頭部的抗體應答,但HA頭部易發(fā)生變異導致病毒抗原漂移,造成疫苗株與流行株抗原不匹配。而疫苗接種不易誘導機體產生靶向HA莖部的抗體。近年來,通過雜交瘤、噬菌體展示、B細胞克隆技術陸續(xù)從人和小鼠分離到對多個流感病毒亞型有廣譜中和活性的單克隆抗體,大多數抗體(如6F12、CR6261、F10、C179、KB2、GG3、2D1等)靶向Group 1 HA,而靶向Group2HA的廣譜中和抗體(CR8020、CR8043、VIS410)及靶向Group1/2HA的單抗(FI6、CR9114、CT149)為數不多,該類抗體有效結合濃度在1-40μg/ml,其中部分抗體不能有效中和H7或H10亞型毒株�？贵w除通過Fab結合病毒抗原發(fā)揮中和活性,在體內抗體也可通過Fc介導抗體依賴性細胞毒效應(antibody dependent cellular cytotoxicity, ADCC)或補體依賴細胞毒效應(complement dependent cytotoxicity, CDC)來殺傷病毒感染的靶細胞。如CR9114抗體在體外不能中和乙型流感病毒,但在體內能通過ADCC保護小鼠免受病毒攻擊。本課題旨在對季節(jié)性流感疫苗人群篩選靶向Group2流感病毒血凝素莖部的廣譜反應性抗體。實驗流程為：1.制備桿狀病毒表達系統(tǒng)表達嵌合cH7/3HA(由A/Netherlands/219/03(H7N7)亞型流感HA頭部和A/Aichi/2/1968(H3N2)亞型HA莖部組成)和ZJH7 (A/Zhejiang/1/2013(H7N9))抗原。2.用cH7/3HA對49名在2009年接種季節(jié)性流感疫苗(A/Brisbane/59/2007(Bris59), A/Brisbane/I 0/2007和B/Brisbane/60/2008)免前0天、免后21天配對血清進行檢測,與cH7/3結合陽性血清再經ZJH7結合ELISA驗證；測定陽性血清中ZJH7結合抗體的親和指數(AI)；用生物素標記的FI6-370(識別Group 1/2 HA莖部)、F10(識別Group 1 HA莖部)抗體進行競爭ELISA檢測；以血凝抑制(HI)實驗明確陽性血清識別的抗原區(qū)域。3.體外培養(yǎng)免后21天外周血記憶性B細胞(CD19+CD27+),取第10天培養(yǎng)細胞上清,用ZJH7抗原檢測,并對陽性孔進行IgG定量,重鏈、輕鏈分型,通過RT-PCR方法建立重鏈、輕鏈基因文庫,組合轉染篩選候選抗體基因,檢測篩選出的陽性抗體與Group2 HA(H3、7、10)抗原和Group1 HA(H1、5、9)抗原的結合活性；并檢測陽性單克隆抗體HI及ADCC效應。結果如下：1.重組蛋白cH7/3、ZJH7HAs可在昆蟲細胞中分泌表達,片段大小約為70kD,純化的cH7/3、ZJH7HAs蛋白以三聚體形式存在,有血凝活性和抗原反應性。2.49名季節(jié)性疫苗接種者中,有六對(編號分別為048、049、057、095、139和152)血清在免后21天對cH7/3結合明顯增加；再以ZJH7抗原檢測這六對血清,只有152血清抗體免后21天與ZJH7結合的抗體滴度比免前高2.1倍以上,具有高親和指數(AI0.5),識別FI6-370及F10相似的HA表位、無HI活性。3.39孔152樣本的外周血記憶性B細胞培養(yǎng)上清對ZJH7抗原結合,最后選擇B細胞狀態(tài)好,重鏈、輕鏈分型檢測OD值0.3以上共9孔進行抗體基因克隆,建立mVH, mVL抗體庫。篩選出單克隆抗體H3-2/κ3-1能結合Group1 HA(H1、5、9)和Group2 HA(H3、7、10)抗原,最低有效結合濃度在30-7.0μg/ml;該抗體重鏈可變區(qū)為VH1-69*01編碼,HCDR3含19個氨基酸,與胚系基因相比VH有12個突變氨基酸位點；輕鏈由VK3-20*O1編碼,LCDR3含9個氨基酸,與胚系基因高度同源。H3-2/κ3-1抗體對Group 1病毒[Bris59HlNl和RGH5N6(含A/Guangdong/1/2014(H5N6) HA NA抗原)]和Group2病毒[RG ZJH7N9和RGH10N8含A/Jiangxi/346/2013(H10N8) HA^ NA抗原)均無HI反應活性。H3-2/κ3-1抗體具有ADCC活性。結論：在季節(jié)性流感疫苗接種個體能檢測到靶向HA莖部的廣譜反應性抗體,檢出率為2%(1/49),成功獲得了一株能廣泛結合Group 1/2 HA的單克隆抗體,最低結合濃度為3.0-7.0μg/ml,具有ADCC效應。
【關鍵詞】：流感病毒 桿狀病毒表達系統(tǒng) Group2血凝素莖部抗體 B細胞 ADCC
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373
【目錄】：

• 縮略詞表6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-17
• 第一節(jié) 流感病毒血凝素在昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)中的表達和生物活性鑒定17-38
• 1 材料與方法17-33
• 1.1 試劑與耗材17-21
• 1.2 方法步驟21-33
• (一) cH7/3、ZJH7基因構建21-24
• (二) Bacmid-cH7/3HA、Bacmid-ZJH7構建24-27
• (三) Bacmid-cH7/3、Bacmid-ZJH7轉染昆蟲sf9細胞27-28
• (四) Bacmid-cH7/3、Bacmid-ZJH7重組蛋白的表達與純化28-29
• (五) cH7/3蛋白和ZJH7蛋白活性的鑒定29-33
• 2 結果及結論33-36
• 3 討論36-38
• 第二節(jié) 季節(jié)性流感疫苗免疫人群血清中Group2 HA莖部廣譜反應性抗體水平的檢測38-53
• 1 材料和方法39-46
• 1.1 材料39-40
• 1.2 方法40-46
• (一) 間接酶聯(lián)免疫吸附實驗篩選Group2 HA莖部廣譜反應性抗體40-41
• (二) 血清抗體親和指數(AI)的測定41-42
• (三) 檢測六對血清是否含有與FI6-370和F10抗體相似的抗原結合表位42-46
• 2 結果及結論46-51
• 3 討論51-53
• 第三節(jié) B細胞培養(yǎng)、抗體重鏈、輕鏈基因克隆及篩選Group2 HA莖部廣譜反應性抗體53-79
• 1 材料和方法53
• 1.1 材料53-54
• 1.2 方法54-69
• (一) 記憶性B細胞培養(yǎng)54-55
• (二) B細胞培養(yǎng)上清中的陽性抗體篩選55-56
• (三) 抗體可變區(qū)基因的擴增,篩選和分析56-64
• (四) 抗體大量表達,純化及鑒定64-69
• 2 結果及結論69-77
• 3 討論77-79
• 結論與展望79-80
• 參考文獻80-88
• 綜述88-106
• 參考文獻99-106
• 致謝106-108
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文108-109
• 附錄 已發(fā)表論文全文109-115

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1 張?zhí)?王炳軍;田國華;田國寧;張金玲;侯志高;韓亮;張麗萍;;流感病毒血凝素受體分子的研究進展[J];中國畜牧獸醫(yī);2010年02期

2 王懋梁;流感病毒血凝素的結構與功能[J];微生物學通報;1986年06期

3 李敏紅;周敏;茅海燕;張嚴峻;盧亦愚;陳寅;;浙江省甲型H1N1流感病毒血凝素基因序列分析[J];中國人獸共患病學報;2013年06期

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5 龔甜;熊英;劉麗萍;王飛霞;施勇;周s，

本文編號：715970