本文關鍵詞：生物反應器（VERO細胞）培養(yǎng)森腦病毒工藝的摸索

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【摘要】：目的利用籃式生物反應器進行vero細胞、森林腦炎病毒的高密度培養(yǎng),探索森林腦炎病毒滅活疫苗制備工藝。森林腦炎病毒液經(jīng)超濾濃縮、β-丙內酯滅活、柱層析純化,為生物反應器制備森林腦炎病毒滅活疫苗的生產(chǎn)工藝和生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)工藝積累經(jīng)驗。方法使用5L、14L籃式生物反應器配合片狀載體培養(yǎng)vero細胞,在細胞培養(yǎng)階段,檢測平臺期細胞密度,并從生物反應器接種細胞量、灌流速度、培養(yǎng)液等方面優(yōu)化vero細胞的培養(yǎng)條件。病毒培養(yǎng)階段,檢測病毒滴度變化,并通過病毒感染復數(shù)、維持液小牛血清濃度、培養(yǎng)基灌流速度等方面優(yōu)化病毒培養(yǎng)條件,從而提高病毒收獲液病毒滴度,并使病毒收獲維持較長的時間。在整個生物反應器培養(yǎng)過程中,檢測培養(yǎng)液中PH、DO葡萄糖濃度、乳酸濃度、滲透壓的變化,通過這一系列的指標來確定生物反應器細胞培養(yǎng)和病毒培養(yǎng)的參數(shù)。收獲的病毒液超濾濃縮、滅活后,經(jīng)Sepharose 4FF柱層析純化得到疫苗原液,按照《中國藥典》三部(2010版)進行相關檢測。結果經(jīng)反復試驗,得到比較適合生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)條件為:細胞培養(yǎng)階段PH為7.2,DO為50~60%,vero細胞的最佳接種量為5~7.5×105cell/ml;病毒培養(yǎng)階段PH為7.4,DO為45~55%,病毒的最佳感染復數(shù)為0.1~0.04。細胞到達平臺期時最高細胞密度可達到1.04×107cell/ml;病毒感染后,約3天左右病毒滴度可以達到8.0 log LD50/m L,每日病毒收獲約一個罐體積,收獲時間可達30~35天,平均病毒滴度為8.4 log LD50/m L。將森腦病毒液通過截留分子量為300KD的Millipore膜包進行超濾濃縮,按0.025%(體積比為1:4000)加入β-丙內酯在4℃滅活48小時可滅活完全。經(jīng)Sepharose 4FF柱層析純化后得到疫苗原液,其雜蛋白去除率高達87.7%,其中抗原含量、小牛血清白蛋白、vero細胞宿主蛋白的殘留量均符合藥典規(guī)定。結論利用生物反應器進行Vero細胞培養(yǎng)制備森林腦炎病毒,條件易于控制,能大量節(jié)約勞動成本,有效減少污染的機率,能得到較高的細胞密度并獲得高毒力的病毒收獲液,為生物反應器制備vero細胞森林腦炎病毒滅活疫苗生產(chǎn)工藝奠定了基礎。
【關鍵詞】：Vero細胞 森林腦炎病毒 生物反應器 片狀載體
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R373.31
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-18
• 1 森林腦炎病毒的生物學特性11-12
• 2 森林腦炎的流行病學特征12-13
• 3 森林腦炎的診斷、預防及治療13-15
• 3.1 森林腦炎的診斷13-14
• 3.2 森林腦炎的預防和治療14-15
• 4 森林腦炎疫苗的研究現(xiàn)狀15-16
• 5 細胞生物反應器的發(fā)展及種類16-17
• 6 微載體培養(yǎng)技術17-18
• 材料與儀器18-22
• 1 材料18-20
• 1.1 細胞18
• 1.2 毒種18
• 1.3 主要試劑18
• 1.4 實驗動物18
• 1.5 常用溶液配制18-20
• 2 儀器20-22
• 方法22-32
• 1 生物反應器參數(shù)調節(jié)及滅菌22-23
• 1.1 pH電極的校正22
• 1.2 溶氧電極校正22
• 1.3 攪拌速度22
• 1.4 溫度22
• 1.5 pH值22
• 1.6 溶氧22-23
• 1.7 生物反應器高壓滅菌23
• 3 細胞培養(yǎng)23-24
• 3.1 vero細胞的復蘇23
• 3.2 細胞傳代培養(yǎng)23-24
• 4 片狀載體細胞計數(shù)24
• 4.1 結晶紫染色計數(shù)法24
• 4.2 胰酶消化計數(shù)法24
• 5 細胞接種24
• 6 病毒培養(yǎng)24-25
• 6.1 病毒接種及培養(yǎng)24-25
• 6.2 MOI計算25
• 7 原液制備25
• 7.1 超濾濃縮25
• 7.2 病毒的滅活25
• 7.3 柱層析純化25
• 8 檢測25-32
• 8.1 葡萄糖濃度測定25-26
• 8.2 乳酸濃度測定26
• 8.3 培養(yǎng)液滲透壓檢測26-27
• 8.4 病毒滴度檢測27
• 8.5 病毒滅活安全試驗27
• 8.6 抗原含量檢測27-28
• 8.7 小牛血清殘留量檢測28-29
• 8.8 Vero細胞宿主蛋白檢測29
• 8.9 Lowry法檢測蛋白含量檢測29-30
• 8.10 DNA殘留量檢測30-32
• 結果32-39
• 1 片狀載體細胞計數(shù)32-33
• 1.1 兩種不同細胞計數(shù)法的比較32
• 1.2 不同細胞接種濃度對平臺期細胞密度的影響32-33
• 2 培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸濃度分析33-34
• 3 滲透壓的影響34
• 4 不同細胞接種濃度對病毒滴度的影響34-36
• 5 MOI（感染復數(shù)）對病毒增殖的影響36-37
• 6 不同小牛血清濃度對病毒滴度的影響37-38
• 7 四批樣品檢定結果38-39
• 結論39-40
• 討論40-43
• 1 片狀載體的細胞計數(shù)的方法40
• 2 葡萄糖、乳酸、滲透壓的影響40-41
• 3 細胞密度、感染復數(shù)對病毒產(chǎn)量的影響41-43
• 參考文獻43-47
• 致謝47

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳浩飛;狂犬病疫苗殘余DNA去除方法研究[D];湖北大學;2012年

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本文編號：714565