本文關(guān)鍵詞：應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選與pGBKT7-CT813編碼產(chǎn)物相互作用蛋白的研究

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【摘要】：目的以pGBKT7-CT813作為誘餌質(zhì)粒與HeLa細(xì)胞酵母GAL4AD融合cDNA文庫(kù)進(jìn)行酵母雙雜交試驗(yàn),以進(jìn)一步探討沙眼衣原體包涵體膜蛋白的生物學(xué)功能。方法根據(jù)STD基因庫(kù)提供信息設(shè)計(jì)引物,用PCR法獲取目的基因片段CT813,經(jīng)酶切處理的CT813和pGBKT7質(zhì)粒,在T4連接酶作用下連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL-21,培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母菌株Y187和AH109中,檢測(cè)其有無(wú)自激活及毒性作用。陽(yáng)性重組酵母菌株AH109與cDNA文庫(kù)菌株Y187進(jìn)行配合,待三葉草(或米奇)形狀合子形成后涂布于腺嘌呤、組氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培養(yǎng)基和鋪有X-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上初篩,再經(jīng)過(guò)2次篩選,收集陽(yáng)性菌落。將陽(yáng)性菌液點(diǎn)種在濾紙上,在液氮中反復(fù)凍融2次,然后浸泡在Z緩沖液-β巰基乙醇-X-Gal混合液中室溫溫育8h。對(duì)篩選出的顯色陽(yáng)性菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證。選取22個(gè)PCR陽(yáng)性菌液提取酵母質(zhì)粒,將22個(gè)質(zhì)粒再轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli,BL-21,對(duì)陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒,進(jìn)行回交試驗(yàn),對(duì)驗(yàn)證陽(yáng)性的菌落對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果成功構(gòu)建了pGBKT7-CT813誘餌質(zhì)粒,該質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)AH109和Y187均無(wú)自激活和毒性作用。將回交試驗(yàn)篩選的陽(yáng)性菌落對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果做BLAST檢索分析,確定篩選出與pGBKT7-CT813特異性相互作用的基因可能編碼的蛋白是:半乳糖凝集素-1(LGALS1)、環(huán)腺苷酸應(yīng)答原件結(jié)合蛋白3(CREB3)、核糖體核糖體蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16)。結(jié)論篩選出的4種蛋白可能與沙眼衣原體的致病機(jī)制相關(guān),但仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。pGBKT7-CT813編碼產(chǎn)物與多種蛋白有相互作用,為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。
【作者單位】： 河北北方學(xué)院病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室;
【關(guān)鍵詞】： pGBKT-CT cDNA文庫(kù) 酵母雙雜交
【分類號(hào)】：R392.1
【正文快照】： 沙眼衣原體是一種具有獨(dú)特發(fā)育周期的病原微生物,其發(fā)育周期即原體→始體→原體,原體代謝能力強(qiáng)但沒有感染性,始體代謝能力弱但感染性強(qiáng)。沙眼衣原體具有嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)特性,主要引起沙眼疾病,也可通過(guò)性傳播途徑引起人類泌尿生殖道感染,侵犯腹股溝淋巴結(jié)引起化膿性淋巴結(jié)

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本文編號(hào)：677753