本文關(guān)鍵詞：過表達(dá)PSMB5抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老進(jìn)程

  更多相關(guān)文章： 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 PSMB5 衰老 蛋白酶體

【摘要】：目的:探究20S蛋白酶體β5亞單位(PSMB5)在人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(h BMSCs)衰老進(jìn)程中的影響,旨在揭示蛋白酶體活性對細(xì)胞衰老的影響,為延緩細(xì)胞的衰老指出一條可行性策略,以期為干細(xì)胞臨床治療研究提供新的思路。方法:分別構(gòu)建PSMB5與綠熒光蛋白(GFP)融合表達(dá)的慢病毒載體感染體外培養(yǎng)晚期的h BMSCs,并依照感染病毒的不同將細(xì)胞分為PSMB5實(shí)驗(yàn)組和GFP對照組。1.通過Real-time PCR和Western bloting驗(yàn)證PSMB5過表達(dá)效率。2.應(yīng)用熒光分光光度法檢測20S蛋白酶體活性。3.利用溴脫氧尿嘧啶核苷(Brd U)免疫熒光染色觀察增殖情況,通過Western來檢測細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白:P21、Cyclin D1、CDK4的表達(dá)變化。4.應(yīng)用SA-β-gal染色法觀察h BMSCs衰老情況。5.在培養(yǎng)基中加入不同濃度(0μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM)的H2O2,形成氧化損傷環(huán)境加速細(xì)胞衰老,探討氧化環(huán)境對細(xì)胞損傷、衰老的影響,應(yīng)用CCK-8法測定氧化應(yīng)激條件下h BMSCs的細(xì)胞活性。結(jié)果:1.Real-time PCR結(jié)果顯示PSMB5-m RNA水平亦較GFP組顯著提高5.24±0.22倍(P0.01),同時(shí)20S蛋白酶體其余亞單位PSMB1、PSMB2、PSMB6的m RNA水平變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;Western bloting結(jié)果顯示PSMB5基因過表達(dá)后在實(shí)驗(yàn)組中PSMB5蛋白表達(dá)水平約為GFP組的2.70±0.19倍(P0.01)。2.PSMB5組中20S蛋白酶體活性升高,相較GFP組為1.55±0.21倍(P0.05)。3.在Brd U免疫熒光實(shí)驗(yàn)中,PSMB5組的Brd U陽性細(xì)胞數(shù)為37.91%±1.82%,而GFP組陽性細(xì)胞數(shù)為28.18%±1.98%(P0.01)。免疫印跡檢測提示PSMB5組中細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)水平較GFP組明顯上調(diào),P21上調(diào)1.45±0.05倍(P0.01)、Cyclin D1上調(diào)1.56±0.16倍(P0.01)、CDK4上調(diào)1.23±0.06倍(P0.05)。4.SA-β-gal染色結(jié)果顯示PSMB5組中衰老陽性細(xì)胞數(shù)40%±3.7%較GFP組的55%±3%偏低(P0.01)。5.CCK-8法檢測細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明,細(xì)胞活性與H2O2濃度之間存有一定的依賴性,h BMSCs的細(xì)胞活力會隨H2O2的孵育濃度升高而降低(P0.01);而在相同的H2O2濃度下,PSMB5組中h BMSCs具有較高的細(xì)胞活性,其中當(dāng)H2O2的孵育濃度為300μM時(shí)的OD值之比約為2.11±0.23倍(P0.01),而當(dāng)濃度為500μM時(shí),兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;測定當(dāng)H2O2的孵育濃度為300μM時(shí)20S蛋白酶體活性的結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSMB5組中20S蛋白酶體活性升高,相較GFP組為1.37±0.12倍(P0.01)。說明在氧化應(yīng)激的條件下,PSMB5過表達(dá)可以保護(hù)細(xì)胞活力,防止細(xì)胞衰老。結(jié)論:1.過表達(dá)PSMB5可以增強(qiáng)h BMSCs 20S蛋白酶體活性,提高細(xì)胞增殖能力,延緩衰老。2.氧化環(huán)境中,過表達(dá)PSMB5可以保護(hù)h BMSCs因氧化應(yīng)激產(chǎn)生的損傷,使細(xì)胞仍保持較高的活性,抑制了細(xì)胞衰老進(jìn)程。提示PMSB5可能是抑制細(xì)胞衰老提高細(xì)胞活力的重要靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 PSMB5 衰老 蛋白酶體
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 常用縮寫詞中英文對照表9-10
• 前言10-12
• 1 材料和方法12-20
• 1.1 材料與試劑12-13
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法13-19
• 1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理19-20
• 2 結(jié)果20-25
• 2.1 PSMB5 基因過表達(dá)效率20-21
• 2.2 hBMSCs蛋白酶體活性的變化21
• 2.3 hBMSCs增殖能力的變化21-23
• 2.4 衰老相關(guān)SA-β-gal染色23
• 2.5 氧化應(yīng)激后hBMSCs的細(xì)胞活性變化23-25
• 3 討論25-28
• 3.1 hBMSCs簡介25
• 3.2 hBMSCs的衰老25
• 3.3 蛋白酶體對hBMSCs功能的作用25-26
• 3.4 過表達(dá)PSMB5 對hBMSCs衰老的影響26-28
• 4 結(jié)論28-29
• 參考文獻(xiàn)29-32
• 綜述32-41
• 參考文獻(xiàn)36-41
• 致謝41-42
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果42-43
• 個(gè)人簡歷43

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 陸利;張衛(wèi)國;楊桂姣;閆八一;白麗敏;;26S蛋白酶體參與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化[J];中國病理生理雜志;2010年03期

2 趙云鶴;張衛(wèi)國;朱茜;楊桂姣;陸利;;蛋白酶體抑制劑MG132對腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖潛能的影響[J];中國病理生理雜志;2011年09期

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本文編號：670557