本文關(guān)鍵詞：cagA和cagL對幽門螺桿菌侵襲細胞功能的影響

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【摘要】：目的:幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)可以侵入胃黏膜上皮細胞并在胃上皮細胞內(nèi)繁殖進而參與致病作用。但幽門螺桿菌侵襲胃黏膜上皮細胞的機制尚不明確。研究已證實細胞的β1整合素可介導Hp侵入細胞,但尚不清楚細菌與侵襲相關(guān)的毒力因子。鑒于此,本研究將從已知幽門螺桿菌的Cag A和Cag L能與β1整合素結(jié)合為切入點,探究cag A和cag L兩基因?qū)p侵襲細胞功能的影響,旨在揭示與Hp侵襲細胞功能相關(guān)的毒力因子。方法:1、幽門螺桿菌NCTC11637cag L缺失株的構(gòu)建參考NCBI Hp J99全基因組序列,設計NCTC11637cag L同源臂,將卡那霉素抗性基因(kanaR)連接到PCR擴增cag L基因兩端區(qū)域產(chǎn)生的兩個同源臂之間,而后插入p Bluescript SKⅡ(-)載體中,構(gòu)建出帶卡那霉素抗性標志的重組質(zhì)粒。運用基因同源重組方法,將此重組質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化到NCTC11637中,以卡那霉素抗性基因替換cag L基因,通過卡那霉素羊血平板篩選出NCTC11637cag L缺失株,命名為NCTC11637Δcag L,傳25代,經(jīng)尿素酶和PCR鑒定,以證實遺傳穩(wěn)定性。2、AGS細胞與SGC7901細胞β1整合素表達驗證采用Trizol法提取兩株細胞的總RNA,通過RT-PCR獲得c DNA,以此為模板PCR,對β1整合素進行m RNA水平表達驗證;利用膜蛋白提取試劑盒提取兩株細胞總膜蛋白,用抗β1整合素抗體進行western blot對β1整合素進行蛋白水平表達驗證。3、cag A和cag L對幽門螺桿菌侵襲AGS細胞與SGC7901細胞功能的影響以NCTC11637、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A(由本實驗室構(gòu)建并保存)感染AGS細胞與SGC7901細胞(MOI=50,MOI為細菌數(shù)和細胞數(shù)的比值),一部分細胞于感染2h后洗滌裂解,裂解物涂布細菌培養(yǎng)板,培養(yǎng)后進行菌落計數(shù),此為粘附細胞細菌數(shù);另一部分細胞感染2h后,利用慶大霉素保護性侵襲實驗,2h后,裂解細胞,裂解物涂布細菌培養(yǎng)板,培養(yǎng)后進行菌落計數(shù),此為侵入細胞菌數(shù)。通過計算侵襲粘附比反映cag A和cag L對幽門螺桿菌侵襲能力的影響,侵襲粘附比=(侵入細胞菌數(shù)/粘附細胞菌數(shù))×100%。4、cag A和cag L對幽門螺桿菌在細胞內(nèi)存活時間的影響以NCTC11637、NCTC11637Δcag L和NCTC11637Δcag A感染AGS細胞(MOI=50),利用慶大霉素保護性侵襲實驗,以含慶大霉素25μg/ml的細胞培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng),分別在24h,36h,48h,72h,96h終止實驗,進行細菌培養(yǎng)和菌落計數(shù)。結(jié)果:1、利用同源重組基因敲除技術(shù)成功構(gòu)建了幽門螺桿菌NCTC11637 cag L缺失株NCTC11637Δcag L;經(jīng)傳25代,尿素酶和PCR鑒定,證明缺失突變株穩(wěn)定;2、AGS細胞和SGC7901細胞均可以表達β1整合素,相對灰度值結(jié)果表明,AGS細胞β1整合素表達(6.387±2.957)高于SGC7901細胞(4.442±2.382);3、cag A和cag L對幽門螺桿菌侵襲AGS細胞與SGC7901細胞功能的影響(1)NCTC11637對AGS細胞的侵襲作用(28.285±4.646%)強于SGC7901細胞(0.194±0.038%);(2)AGS細胞中,NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比分別為28.285±4.646%、9.055±3.104%和9.225±0.417%,NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比均顯著低于NCTC11637(P0.05),NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L侵襲粘附比差異無顯著性;(3)SGC7901細胞中,NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比分別為0.194±0.038%、0.029±0.007%和0.061±0.009%,NCTC11637Δcag A的侵襲粘附比顯著低于NCTC11637(P0.01),NCTC11637Δcag L的侵襲粘附比顯著低于NCTC11637(P0.05)。4、NCTC11637、NCTC11637Δcag A和NCTC11637Δcag L感染AGS細胞后,隨著培養(yǎng)時間延長,胞內(nèi)細菌數(shù)逐漸減少,NCTC11637Δcag L在胞內(nèi)可存活72h,NCTC11637Δcag A和NCTC11637可存活48h。結(jié)論:1、AGS細胞和SGC7901細胞均表達β1整合素,AGS細胞β1整合素的表達量高于SGC7901細胞。2、幽門螺桿菌對AGS細胞的侵襲作用強于SGC7901細胞。3、cag A和cag L與幽門螺桿菌侵襲細胞功能相關(guān)。4、cag A和cag L缺失后幽門螺桿菌仍可在細胞內(nèi)定植存活。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 cagA cagL β1整合素 細胞侵襲
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 附錄一 英文縮略語4-5
• 附錄二 試劑配方5-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-37
• 結(jié)果37-46
• 討論46-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻50-53
• 綜述53-65
• 參考文獻59-65
• 致謝65

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 張會東,鮑朗,趙計林,朱慶平,李婭莎;賴型鉤端螺旋體017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突變株的構(gòu)建[J];中華微生物學和免疫學雜志;2005年07期

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本文編號：623614