本文關鍵詞：FKBP52通過FOXA1調節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體AR的平衡

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【摘要】：第一部分 FKBP52通過FOXA1調節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體All的平衡[目的]ER與AR同屬于甾體激素受體超家族的成員,其平衡對生物體正常的生長發(fā)育過程至關重要。健康女性中ER和AR的表達量相當,而一些ER和AR失衡的組織內(nèi)疾病的發(fā)生率要顯著高于正常組織,說明其平衡在人體穩(wěn)態(tài)中的重要性。FKBP52是一種共伴侶蛋白通過參與形成激素受體復合物發(fā)揮功能。FKBP52敲除雄性小鼠存在乳腺發(fā)育的表型,前期研究發(fā)現(xiàn)FKBP52對ER/AR平衡產(chǎn)生影響,但具體的分子機制還缺乏了解。本課題通過對RNA-seq結果分析,結合免疫組化的結果,提出FKBP52可能通過FOXA1的影響ER與AR的平衡,并探究具體的分子機理。通過研究FKBP52基因敲除雄性小鼠乳腺發(fā)育的表型,對了解FOXA1在乳腺發(fā)育中及對ER和AR平衡的作用具有重要意義。[方法]1)表型分析及行為學實驗。測量突變雄鼠、野生雌鼠和野生雄鼠的腳趾第二指及第四指的長度并計算比值,以及觀察突變雄鼠行為學方面的改變。2)fRNA-seq測序。分離提取10天大小的突變雄鼠、野生雌鼠的乳頭和野生雄鼠相應部位皮膚組織的RNA,測序篩選得到一些影響乳腺發(fā)育的基因；通過對測序數(shù)據(jù)的分析找到可能影響乳腺發(fā)育的信號通路。3) Real-time PCR驗證。將用作測序的同一批次的RNA逆轉錄成cDNA,通過Real-time PCR以驗證ER、AR以及一些變化較大的影響乳腺發(fā)育的基因的表達情況。4)免疫組化實驗。對相關基因在乳腺中的表達分布情況進行檢測。5)體外細胞實驗。小鼠MEF細胞中檢測FKBP52、FOXA1、ERα的表達情況,人的乳腺癌細胞系中通過干擾和過表達FKBP52基因的表達檢測FOXA1的變化。6)放線菌酮(CHX)檢測蛋白穩(wěn)定性。7)Co-IP實驗。探究FKBP52與FOXA1在蛋白水平的相互作用。[結果]1)突變雄鼠表型區(qū)別于野生雄鼠指長比2D:4D≥1,并且行為學實驗結果顯示突變雄鼠傾向于待在雄鼠用過的墊料內(nèi),這一選擇與野生雌鼠相似；綜上突變雄鼠表現(xiàn)出雌性化特征；2)RNA測序結果顯示突變雄鼠基因表達譜與野生雌鼠基本一致,FOXA1、CITED1、wnt5a、Col4a2、 sox-15、sox-7、krt6-b、 Ihh、btc、Igfbp2基因發(fā)生明顯變化；3)Real-time驗證結果與測序結果相同；4)免疫組化實驗結果發(fā)現(xiàn)在FKBP52敲除雄鼠乳腺中ERa表達上升,同時ERa的表達趨勢與FOXA1非常相近；5)FKBP52敲除的小鼠MEF細胞FOXA1表達缺失,ERa表達上調,而在野生的MEF細胞中過表達FKBP52發(fā)現(xiàn)FOXA1表達降低的現(xiàn)象,說明FKBP52與FOXA1之間存在極強的調控關系,而雌激素處理實驗也證明了FKBP52對FOXA1的調控依賴于ER。而在ER(+)的人乳腺癌細胞系MCF-7 和 ER (-)的 SK-BR-3中通過干擾和過表達FKBP52基因,發(fā)現(xiàn)在ER(+)的MCF-7細胞內(nèi)降低FKBP52的表達會造成FOXA1升高,過表達FKBP52后FOXA1表達降低,而在ER(-)的SK-BR-3細胞則沒有觀察到這種變化,同樣說明FKBP52和FOXA1在細胞內(nèi)存在直接調控關系,并且這種調控依賴雌激素受體ER；6)放線菌酮處理(CHX)實驗揭示FKBP52降低后FOXA1蛋白穩(wěn)定性增強；7)Co-IP實驗顯示FKBP52和FOXA1在蛋白水平存在直接的相互作用。[結論]在FKBP52基因敲除雄鼠中,FKBP52的缺失造成了FOXA1蛋白穩(wěn)定性增強,進而影響了FOXA1的表達導致下游ER活性的增強并最終改變ER/AR間的平衡,這可能是產(chǎn)生雄鼠乳腺異常發(fā)育現(xiàn)象的原因。第二部分 一種gRNA快速合成及檢測方法的建立[目的]建立一種gRNA快速合成及體外檢測的方法。[方法]設計引物并利用PCR技術迅速擴增gRNA的DNA模板片段,然后通過體外轉錄純化得到gRNA；最后通過體外反應迅速對gRNA和Cas9酶切效率及特異性進行檢測。[結果]體外合成的gRNA特異性強,活性高,在靶點上成功切開DNA雙鏈。[結論]成功建立gRNA快速合成及檢測的方法,為后續(xù)轉染或顯微注射篩選有活性gRNA節(jié)約了時間。
【關鍵詞】：FKBP52敲除 FOXA1 ER AR 乳腺發(fā)育 CRISPR/Cas9 PCR擴增 體外轉錄 體外檢測
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R33
【目錄】：

• 第一部分：FKBP52通過FOXA1調節(jié)雌激素受體ER和雄激素受體AR的平衡4-49
• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-20
• 材料和方法20-33
• 材料20-23
• 實驗方法23-33
• 實驗結果33-46
• 討論46-49
• 第二部分：一種gRNA快速合成及檢測方法的建立49-59
• 摘要49
• Abstract49-50
• 前言50-51
• 實驗材料51-52
• 實驗方法52-53
• 實驗結果53-58
• 討論58-59
• 英文縮略表59-60
• 參考文獻60-68
• 致謝68-69
• 個人基本情況69-70
• 碩士期間論文發(fā)表情況及學術表現(xiàn)70-71

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本文編號：568930