本文關(guān)鍵詞：激活素A在雞胚背根神經(jīng)節(jié)發(fā)育過程中的作用

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【摘要】：激活素A（Activin A）屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族的多功能生長和分化因子，分布廣泛，在初期胚形成、神經(jīng)細(xì)胞分化發(fā)育、造血細(xì)胞增殖和分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展、性激素分泌調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用。其受體屬于TGF-β超家族的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶型受體，由Ⅰ型和Ⅱ型受體組成。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Activin A具有促進雞胚背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion, DRG）神經(jīng)突起生長、維持神經(jīng)元生存等作用，但其在DRG發(fā)育過程中的作用仍不清楚。因此，本研究通過分析不同日齡雞胚DRG組織中Activin A及其受體、信號傳導(dǎo)蛋白Smads等的表達，探討Activin A與DRG發(fā)育的關(guān)系，并通過檢測神經(jīng)元神經(jīng)遞質(zhì)釋放等，進一步分析ActivinA在DRG發(fā)育過程中的作用機制。 一、實驗方法 體外培養(yǎng)8d雞胚DRG，觀察Activin A及神經(jīng)生長因子（nerve growth factor,NGF）對DRG神經(jīng)突起生長的影響；選擇不同日齡（8d、10d、12d、14d、16d、18d）的雞胚DRG，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）、免疫組織化學(xué)染色等方法，分析Activin A、激活素ⅡA型受體（activintype IIA Receptor, ActRⅡA）以及激活素ⅡB型受體（Activin typeⅡB Receptor,ActRⅡB）、信號傳導(dǎo)蛋白Smads等在不同日齡雞胚DRG中的表達情況；體外培養(yǎng)8d雞胚DRG神經(jīng)細(xì)胞，回收培養(yǎng)上清，酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linkedimmunosorbent assay, ELISA）檢測神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素（norepinephrine, NE）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）等分泌水平。 二、實驗結(jié)果 1. Activin A促進雞胚DRG神經(jīng)突起生長 采用8d雞胚，在解剖顯微鏡下直接分離DRG，接種48孔培養(yǎng)板，實驗分為Activin A組、Activin A+抗NGF抗體組、Activin A+FS組、NGF組、NGF+抗NGF抗體組和NGF+FS組，體外培養(yǎng)1~3d，每天觀察雞胚DRG神經(jīng)突起生長情況。結(jié)果顯示ActivinA可以促進DRG神經(jīng)突起生長，其作用不受抗NGF抗體影響，而抗NGF抗體則可阻斷NGF促進的DRG神經(jīng)突起生長。上述結(jié)果表明Activin A促進DRG神經(jīng)突起生長不依賴于內(nèi)源性NGF。 2. Activin A及其受體、Smads表達與雞胚DRG發(fā)育的相關(guān)性 為了探討ActivinA在DRG發(fā)育過程中的作用，分別取不同日齡（8d、10d、12d、14d、16d、18d）雞胚的DRG進行研究。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，隨著時間的推移，Activin A及ActRⅡA、ActRⅡB mRNA表達量逐漸下降，而激活素結(jié)合蛋白FS mRNA表達量逐漸增加，激活素信號傳導(dǎo)蛋白Smad3mRNA表達量逐漸降低，而Smad2mRNA表達量無明顯變化。免疫組織化學(xué)染色顯示ActivinA在雞胚DRG神經(jīng)細(xì)胞胞漿中表達，在8~12d表達量較高，隨著DRG的發(fā)育，在14d、16d、18d的表達逐漸降低，ActRⅡA及ActRⅡB與ActivinA表達相一致，而激活素結(jié)合蛋白FS隨著時間的推移表達逐漸升高。免疫熒光化學(xué)染色顯示ActRⅡA及神經(jīng)元骨架蛋白MAP2在DRG神經(jīng)元共表達，而且ActRⅡA也在12d的DRG神經(jīng)元表達最高，隨后逐漸下降，上述研究表明在雞胚DRG的發(fā)育過程中，Activin A可能參與了DRG早期發(fā)育過程，而隨著DRG的發(fā)育，其作用逐漸減弱。 3. Activin A參與雞胚DRG發(fā)育過程的可能機制分析 采用體外培養(yǎng)8d雞胚DRG單細(xì)胞，通過甲苯胺藍染色尼氏小體，研究發(fā)現(xiàn)Activin A具有抑制DRG膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用，而NGF不能有效抑制膠質(zhì)細(xì)胞X椫場；厥張嘌ε逥RG細(xì)胞上清，ELISA法檢測神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA、ACh、Glu、GABA的釋放情況，結(jié)果顯示Activin A及NGF組5-HT、NE和GABA水平明顯升高，統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著（p0.05, p0.01），而Glu水平則下降（p0.05,p0.01），但對DA、ACh的分泌無明顯影響。RT-PCR檢測結(jié)果顯示，Activin A對培養(yǎng)的雞胚DRG神經(jīng)細(xì)胞NGF及其受體的表達無明顯影響。上述研究表明Activin A可能通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖和調(diào)控神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、GABA及Glu釋放，參與DRG的發(fā)育過程。 三、結(jié)論 上述研究表明，ActivinA具有促進DRG神經(jīng)突起生長作用，，其作用不依賴于內(nèi)源性的NGF；ActivinA及其受體表達水平與DRG發(fā)育過程相關(guān)；ActivinA具有抑制膠質(zhì)細(xì)胞X椫場⒋俳

本文編號：560256