本文關(guān)鍵詞：心型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備及應(yīng)用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：心型脂肪酸結(jié)合蛋白(Heart Fatty Acid-binding Protein, H-FABP)是一種在心肌細(xì)胞中含量豐富的小分子量心肌可溶性蛋白,由于其分子量小的特點,在心肌受損后,2-3小時血清濃度即開始上升。檢測病人血清中的H-FABP含量從而能確定心梗的發(fā)生。每年全球因心血管疾病死亡的人數(shù)占全球死亡人數(shù)的1/3。而在心梗發(fā)生6小時內(nèi)實施再灌注治療,則死亡率降低到1%之內(nèi),為此早期診斷AMI有著十分重要的意義。而H-FABP作為一種早期的AMI心肌標(biāo)志物就同樣具有著重要的研究意義。本文通過重組H-FABP蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾臟的B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合。經(jīng)過亞克隆篩選出3株高效價的細(xì)胞株,分別命名為2C06、2F08、6G03。將三株雜交瘤細(xì)胞接種于BALB/c小鼠內(nèi)大規(guī)模制備單克隆抗體。采用Protein G親和柱純化抗體后,經(jīng)鑒定3株單克隆抗體均為IgG類,效價均達(dá)到1：106以上,親和力達(dá)到108以上。同時特異性檢測和Western blot均表明3株抗體有較好的特異性。采用雙抗體夾心ELISA配對抗體,篩選出以61G03為包被抗體與2F08為標(biāo)記抗體配對能檢測出H-FABP抗原,用這對抗體建立了酶聯(lián)免疫分析方法和膠體金免疫層析法。通過優(yōu)化條件,建立的酶聯(lián)免疫分析方法的檢測范圍為0ng·mL-1～200 ng·mL-1,標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.9935,有較好的線性相關(guān)性。通過檢測臨床樣本測定出正常人群血清中的H-FABP平均含量為2.6621±0.1321 ng·mL-1、AMI患者H-FABP平均含量為22.4897±1.8217 ng·mL-1, P0.05,表明正常人血清中H-FABP含量與AMI患者血清中H-FABP含量有著顯著性差異。建立的膠體金免疫層析法的最低檢出濃度為10 ng·mL-1,通過檢測131例臨床樣本,與臨床結(jié)果對照,敏感度為86.96%,特異度為97.65%,Kappa值為0.8633,一致性檢測表明膠體金試紙條檢測結(jié)果與臨床確診結(jié)果無顯著性差異。所以建立的酶聯(lián)免疫分析法和膠體金免疫層析法都適合H-FABP的檢測。H-FABP單克隆抗體的制備以及免疫分析方法的建立為國內(nèi)AMI早期診斷試劑盒的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。進(jìn)一步研發(fā)更優(yōu)秀的免疫分析方法檢測H-FABP試劑盒,將會明顯的改善我國檢測H-FABP依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀,明顯降低醫(yī)療成本。
【關(guān)鍵詞】：心型脂肪酸結(jié)合蛋白 單克隆抗體 酶聯(lián)免疫分析 膠體金
【學(xué)位授予單位】：廣東工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392-33
【目錄】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-7
• 目錄7-10
• CONTENTS10-13
• 第一章 緒論13-25
• 1.1 FABP概述14-15
• 1.1.1 FABP的特性14
• 1.1.2 FABP的結(jié)構(gòu)特點14
• 1.1.3 FABP的生物學(xué)功能14-15
• 1.2 FABP的臨床應(yīng)用15-16
• 1.2.1 用于AMI的早期特異性診斷15
• 1.2.2 用于梗塞面積的早期估計15
• 1.2.3 用于監(jiān)測AMI的復(fù)發(fā)15-16
• 1.3 H-FABP分析檢測方法研究進(jìn)展16-17
• 1.3.1 放射免疫法16
• 1.3.2 酶聯(lián)免疫吸附法16
• 1.3.3 免疫比濁法16-17
• 1.3.4 膠體金層析法17
• 1.4 免疫分析測試技術(shù)介紹17-23
• 1.4.1 基本定義18-19
• 1.4.2 免疫分析方法研究進(jìn)展19-23
• 1.5 課題研究的目的及其意義23-24
• 1.6 本課題的研究思路及內(nèi)容24
• 1.7 課題來源24-25
• 第二章 H-FABP單克隆抗體的制備25-48
• 2.1 前言25
• 2.2 材料與試劑25-28
• 2.2.1 動物與細(xì)胞25
• 2.2.2 主要試劑和材料25-26
• 2.2.3 實驗儀器26-27
• 2.2.4 溶液配制27-28
• 2.3 實驗方法28-40
• 2.3.1 動物免疫28
• 2.3.2 免疫血清效價測定28-29
• 2.3.3 制備雜交瘤細(xì)胞29-31
• 2.3.4 雜交瘤的篩選及亞克隆31-33
• 2.3.5 單克隆抗體的大規(guī)模制備33
• 2.3.6 單克隆抗體的純化33-35
• 2.3.7 H-FABP單克隆抗體的性質(zhì)鑒定35-40
• 2.4 實驗結(jié)果40-47
• 2.4.1 免疫血清效價測定40-41
• 2.4.2 雜交瘤細(xì)胞的觀察和篩選41
• 2.4.3 腹水純化后抗體的含量41-42
• 2.4.4 SDS-PAGE電泳測定抗體純度42
• 2.4.5 腹水純化后效價測定42-43
• 2.4.6 抗體亞型的測定43
• 2.4.7 抗體親和力常數(shù)的測定43-45
• 2.4.8 抗體的特異性結(jié)果45-47
• 2.4.9 WESTERN BLOT測定抗體結(jié)果47
• 2.5 本章小結(jié)47-48
• 第三章 H-FABP單克隆抗體的免疫分析方法的建立48-62
• 3.1 前言48
• 3.2 儀器與試劑48-49
• 3.2.1 試劑與材料48
• 3.2.2 儀器與設(shè)備48-49
• 3.3 實驗方法49-55
• 3.3.1 酶聯(lián)免疫分析法的建立49-51
• 3.3.2 膠體金免疫層析法的建立51-55
• 3.4 結(jié)果與分析55-61
• 3.4.1 酶聯(lián)免疫分析法測定H-FABP55-56
• 3.4.2 膠體金免疫層析法測定H-FABP56-61
• 3.5 本章小結(jié)61-62
• 第四章 H-FABP單克隆抗體免疫分析方法的應(yīng)用62-66
• 4.1 前言62
• 4.2 實驗材料62
• 4.3 實驗方法62-65
• 4.3.1 樣本血清的收集62
• 4.3.2 H-FABP抗體的制備、純化以及鑒定62-63
• 4.3.3 H-FABP的檢測63
• 4.3.4 實驗結(jié)果63-65
• 4.4 本章小結(jié)65-66
• 結(jié)論與展望66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文74-76
• 致謝76

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：390581