本文關(guān)鍵詞：畢赤酵母中人RANK胞外段的表達純化及其阻斷作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：NF-κB的受體活化因子配體/受體(RANKL/RANK)信號介導(dǎo)破骨細胞形成和骨吸收。此外,此信號還可以影響其他生物學過程,包括免疫系統(tǒng)和癌癥。RANKL/RANK信號在淋巴結(jié)發(fā)育、淋巴細胞分化、樹突狀細胞存活、T細胞活化和免疫耐受誘導(dǎo)中均扮演著重要角色。因此,抑制RANKL為阻止骨疾病、癌癥病人的骨轉(zhuǎn)移、骨免疫相關(guān)疾病、打破中樞免疫耐受促進抗腫瘤免疫應(yīng)答T細胞的發(fā)生等提供一個新的思路與治療手段。本研究首先對人RANK胞外段序列進行畢赤酵母表達系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化,然后克隆到pPIC9K酵母表達載體中,將重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母,篩選獲得高表達RANK胞外段蛋白(RANK-N)的菌株。我們通過SDS-PAGE、考馬斯亮藍染色和Western Blot鑒定,證實所構(gòu)建表達菌株及目的蛋白的正確性。經(jīng)過搖瓶表達的超濾、Sephadex G-50凝膠過濾層析和Q Sepharose FF離子交換層析三個步驟純化重組蛋白,獲得了純度在95%以上的目的蛋白。利用等離子共振(SPR)技術(shù)分析重組RANK蛋白與RANKL蛋白之間的親和力,進而證實了重組RANK-N能結(jié)合RANKL。通過一系列體外體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)重組RANK-N蛋白能夠阻斷RANKL激活的RANK信號。此外,我們利用人結(jié)直腸癌小鼠移植瘤模型(patient derived xenograft,PDX)發(fā)現(xiàn)RANK胞外段蛋白可以抑制人結(jié)腸癌的生長。通過此項研究,我們建立了一個簡單有效、可線性放大的RANK-N表達純化系統(tǒng),為最終的大規(guī)模生產(chǎn)及成果轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：RANK 畢赤酵母 蛋白純化 骨疾病 結(jié)腸癌
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R363
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-7
• 縮略詞索引7-8
• 1.引言8-19
• 1.1 RANK8-10
• 1.2 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)10-11
• 1.3 RANK/RANK/OPG簡介11-18
• 1.4 研究目的18-19
• 2.材料和方法19-40
• 2.1 材料19-25
• 2.2 方法25-40
• 3.結(jié)果40-50
• 3.1 克隆RANK胞外端基因40-41
• 3.2 篩選獲得畢赤酵母較高表達菌株41-42
• 3.3 RANK-N表達菌株蛋白搖瓶表達、純化和糖基化鑒定42-46
• 3.4 RANK-N的體外功能46-49
• 3.5 RANK-N的體內(nèi)功能49-50
• 4.討論和結(jié)論50-54
• 參考文獻54-62
• 致謝62-64
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄64-65
• 綜述65-73
• 參考文獻70-73

【共引文獻】

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本文編號：386724