本文關(guān)鍵詞：可溶性重組人精囊蛋白1片段的原核表達(dá)及其對精子活力的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：近年來,國內(nèi)外針對男性避孕疫苗的研究取得了突出的進(jìn)展,主要集中于:(1)幾種非常有潛能的重要蛋白被發(fā)現(xiàn),包括Eppin,FSHR,Izumo,CRISP-1,Cat Sper1等[1-5];(2)佐劑及免疫誘導(dǎo)等方面更成熟。這些為研制高效、可逆性避孕疫苗提供了重要的前提條件。然而,由于天然自身抗原的抗原性弱,且缺乏蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的解析,嚴(yán)重制約了對其關(guān)鍵功能域的改造研究,迄今仍無理想的避孕疫苗問世。人精囊蛋白屬于快速進(jìn)化類蛋白,在人體多個組織中都有表達(dá),包括腫瘤組織。人精囊蛋白可以分為兩種類型,即精囊蛋白I(semenogelin I,SEMG1)和精囊蛋白Ⅱ(semenogelin II,SEMG2)。在射精時,精囊蛋白與精液混合,形成精液凝膠,抑制精子向前運(yùn)動。目前的研究表明:在機(jī)體內(nèi),金屬離子與蛋白質(zhì)的結(jié)合對控制諸如記憶、學(xué)習(xí)等生理過程發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用,精囊蛋白亦是如此。鋅離子與精囊蛋白結(jié)合后,通過改變蛋白的三級結(jié)構(gòu),從而控制精囊蛋白相關(guān)作用的發(fā)揮。除此以外,精子細(xì)胞膜表面的鈣離子泵,目前認(rèn)為與精子活力的變化息息相關(guān)。精囊蛋白必須通過與精子尾部表面Eppin蛋白相結(jié)合,再與叢生蛋白、乳鐵蛋白形成一種稱為EPC的復(fù)合物,從而發(fā)揮其生物學(xué)活性。將重組Eppin蛋白主動免疫雄性猿猴后,可以檢測到特異性抗Eppin抗體,且免疫后78%雄性不育�？笶ppin抗體的結(jié)構(gòu)與SEMG結(jié)構(gòu)非常相似。因此,本研究認(rèn)為,通過研究SEMG1蛋白結(jié)構(gòu)及其與Eppin相互作用位點(diǎn),可能為新型免疫避孕疫苗的研究提供依據(jù)。本課題計(jì)劃通過原核表達(dá)足量可溶性重組蛋白,為下一階段蛋白質(zhì)結(jié)晶與晶體結(jié)構(gòu)解析做準(zhǔn)備,進(jìn)而為候選疫苗研究提供條件。本課題分為以下三個部分:第一部分:SEMG1與△SEMG1蛋白質(zhì)氨基酸序列分析,運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件對蛋白氨基酸序列及二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析、比較;第二部分:構(gòu)建△SEMG1可溶性蛋白質(zhì)的原核表達(dá)體系,探尋重組蛋白最佳表達(dá)載體,大量表達(dá)的最優(yōu)誘導(dǎo)條件以及純化方式等;第三部分:純化后的重組蛋白的功能驗(yàn)證。結(jié)果:1、△SEMG1蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中共有5個α-螺旋,4個β-折疊片,且分布不規(guī)則;△SEMG1蛋白片段具有較強(qiáng)的抗原性與親水性;△SEMG1結(jié)構(gòu)分析表明相對SEMG1更適合用于重組目的蛋白表達(dá);2、從多種原核表達(dá)載體及工程菌中(包括帶有sumo標(biāo)簽質(zhì)粒、pet-28b質(zhì)粒、ROSETTA等)中經(jīng)優(yōu)化改良,最終獲得可溶性重組蛋白;3、經(jīng)反復(fù)嘗試,最終獲得了結(jié)合Amylose層析柱、TEV酶過夜酶切、目的蛋白Ni柱純化以及分子篩純化相結(jié)合的純化方式,并獲得高純度、可溶性目的蛋白;4、純化后的△SEMG1重組蛋白經(jīng)Western blot驗(yàn)證為與理論分子量大小一致的蛋白質(zhì),且經(jīng)質(zhì)譜分析證實(shí)為△SEMG1;5、純化后的△SEMG1重組蛋白對精子活力有明顯的抑制效應(yīng)。綜上所述,本研究通過分析SEMG1蛋白質(zhì)氨基酸序列及其二級結(jié)構(gòu)特點(diǎn),確定其165~281aa,即△SEMG1為研究目標(biāo);在p Mal-c2x-TEV載體上成功地插入△SEMG1基因片段,構(gòu)建了可表達(dá)可溶性△SEMG1重組蛋白的重組質(zhì)粒;并進(jìn)一步探索出目的蛋白的純化方法及其最佳純化條件;驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示可溶性的△SEMG1重組蛋白具有顯著地抑制精子活力的作用。本研究是首次在原核表達(dá)系統(tǒng)下獲得的可溶性的△SEMG1蛋白,為后續(xù)功能研究、結(jié)構(gòu)分析以及非甾體類避孕疫苗的研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：精囊蛋白 原核表達(dá) 可溶性蛋白 精子活力 避孕
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R392
【目錄】：

• 縮略詞語表4-6
• 英文摘要6-8
• 中文摘要8-10
• 前言10-13
• 第一章 SEMG1與△SEMG1的序列分析13-21
• 1.1 實(shí)驗(yàn)方法13-15
• 1.2 結(jié)果15-20
• 1.3 討論20-21
• 第二章 可溶性△SEMG1重組蛋白的原核表達(dá)與純化21-46
• 2.1 材料與方法21-37
• 2.2 結(jié)果37-44
• 2.3 討論44-46
• 第三章 重組△SEMG1蛋白的功能實(shí)驗(yàn)46-51
• 3.1 材料與方法46-48
• 3.2 結(jié)果48-49
• 3.3 討論49-51
• 全文總結(jié)51-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 文獻(xiàn)綜述 人精囊蛋白1的研究進(jìn)展56-66
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 碩士期間發(fā)表論文的情況66-67
• 致謝67

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本文編號：373958