本文關(guān)鍵詞：冷凍技術(shù)對精子印記基因DNA甲基化及結(jié)構(gòu)影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：1.檢測精子庫常規(guī)精液冷凍技術(shù)中冷凍保護(hù)劑、冷凍過程及冷凍時間長短三個因素對精子父源印記基因H19及母源印記基因MEST印記控制區(qū)域(imprinting control region, IC R)的DNA甲基化的影響程度,為冷凍精子在表觀遺傳方面的安全性提供參考依據(jù)。2.檢測精子庫常規(guī)精液冷凍技術(shù)對精子DNA完整性、膜完整性及頂體完整性的影響程度,為冷凍精子在結(jié)構(gòu)方面的安全性提供參考依據(jù)。3.檢測樣品“雪域圣寶”對人類精子影響體外實驗的效果。方法：1.以10例符合精子庫捐精條件的正式志愿者為研究對象,將其每份精液樣品平均分為4組：A組為新鮮精液,作為對照；B組加入同體積冷凍保護(hù)劑,不冷凍；C組加同體積冷凍保護(hù)劑,冷凍2d；D組加同等體積冷凍保護(hù)劑,冷凍兩個月。通過亞硫酸氫鹽克隆測序法(BSP)分析父源印記基因H19及母源印記基因MESTICR的DNA甲基化狀態(tài)。2.以10例符合精子庫捐精條件的初篩志愿者為研究對象,對照組為新鮮精液,實驗組加同體積的冷凍保護(hù)劑,冷凍7d。通過精子染色質(zhì)擴(kuò)散實驗(SCD)檢測精子DNA完整性,通過改良6-羧基二乙酸熒光素/碘化丙啶(6-CFDA/PI)雙熒光標(biāo)記方法檢測精子質(zhì)膜完整性,通過人精子豌豆凝集素(PSA)熒光染色檢測精子頂體完整性。3.以20例符合精子庫捐精條件的初篩志愿者為研究對象,對照組：0.5 ml精液與0.5 ml生理鹽水混合；實驗組：0.5 ml精液與0.5 m1雪域圣寶混合,CASA計算加藥前、0.5 h、3 h和24 h精子的活動率、平均路徑速率VAP、曲線速率VCL和直線速率VSL,0.5 h通過PSA熒光染色對精子頂體狀態(tài)進(jìn)行評估,3 h時通過酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)對精漿中DNA氧化損傷生物標(biāo)志物(8-OHdG)含量進(jìn)行評估,24 h時通過伊紅-苯胺黑法對質(zhì)膜完整性進(jìn)行評估。結(jié)果：1A、B、C、D組H19基因ICR區(qū)的DNA甲基化率以克隆數(shù)計算時分別為58.70%、53.85%、49.46%和45.74%,以CpG島數(shù)計算時分別為97.57%、97.33%、97.13%和96.56%,兩者都有降低趨勢,但組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；四組MEST基因ICR區(qū)甲基化率以克隆數(shù)計算時分別為41.10%、45.33%、47.30%和50.68%,以CpG島數(shù)計算甲基化率時分別為1.77%、1.74%、2.00%和2.26%,有升高趨勢,但差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.冷凍7d的實驗組DNA完整率為(74±4.64)%,與未冷凍對照組(80±5.42)%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；實驗組膜完整率為(68±6.23)%,與對照組(75±5.82)%相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；實驗組頂體完整率為(77±6.13)%,與對照組(82±5.71)%相比,差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.實驗組不同時點CASA分析精子活動率、VAP、VCL和VSL結(jié)果,與對照組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；實驗組0.5 h頂體完整率、3 h精漿中8-OhDG含量及24 h質(zhì)膜完整性,與對照組相比,差異亦均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：1.常規(guī)精液冷凍復(fù)蘇技術(shù)對父源印記基因H19及母源印記基因MEST的ICR區(qū)甲基化程度未見明顯影響,精子冷凍技術(shù)在DNA甲基化方面是安全的。2.常規(guī)精液冷凍復(fù)蘇技術(shù)對精子結(jié)構(gòu)方面,如對DNA完整性、膜完整性及頂體反應(yīng)發(fā)生率產(chǎn)生較明顯影響。3.樣品“雪域圣寶”對人類精子影響體外實驗的效果顯示：未見有明顯保護(hù)或促進(jìn)作用。
【關(guān)鍵詞】：精液冷凍 DNA甲基化 核DNA完整性 膜完整性 頂體完整性
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R321.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-12
• 參考文獻(xiàn)10-12
• 第一部分：冷凍技術(shù)對精子印記基因DNA甲基化影響的研究12-31
• 1. 實驗材料12-14
• 1.1 主要儀器12-13
• 1.2 主要試劑13-14
• 1.3 主要溶液14
• 2. 實驗方法14-21
• 2.1 標(biāo)本采集與分組14-15
• 2.2 精液冷凍復(fù)蘇15-16
• 2.3 精子DNA提取16
• 2.4 亞硫酸氫鹽處理16-18
• 2.5 目的片段擴(kuò)X，
  
  本文編號：373390
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