化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）是一類嚴(yán)格以人作為宿主的鏈球菌,廣泛存在于人的糞便和鼻咽部位,可引起從普通非侵襲性疾病如咽炎、猩紅熱、膿皰病到侵襲性和嚴(yán)重侵襲性疾病如風(fēng)濕熱等疾病的常見(jiàn)人類專性致病菌。鏈球菌溶血素O（Streptolysin O; SLO）是鏈球菌產(chǎn)生的重要毒素之一。它不僅可以引起溶血,同時(shí)也可強(qiáng)烈引起真核細(xì)胞膜損傷,影響細(xì)胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程,使靶細(xì)胞釋放胞內(nèi)成分并致溶解,SLO在鏈球菌感染過(guò)程中起著重要作用。生物信息分析化膿性鏈球菌溶血素O蛋白結(jié)構(gòu)表明,SLO蛋白除含有由461氨基酸殘基組成的溶血活性結(jié)構(gòu)域Thiol_cytolysin外,在N端還有一跨膜結(jié)構(gòu)域。本研究利用pET101-GENE蛋白表達(dá)系統(tǒng),成功構(gòu)建出高表達(dá)具有SLO活性的重組蛋白重組子,采用鎳柱親和層析分離技術(shù),純化目的蛋白；純化蛋白SDS-PAGE檢測(cè)分析表明,重組蛋白與預(yù)測(cè)的溶血活性結(jié)構(gòu)域的分子量相一致；溶血實(shí)驗(yàn)顯示,純化重組蛋白具有溶血活性。以純化的重組蛋白為免疫原,對(duì)大鼠進(jìn)行4次免疫,所獲得免疫血清經(jīng)Elisa檢測(cè),抗SLO血清效價(jià)達(dá)到1：12... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 GAS引起感染相關(guān)的毒力因子
        1.1.1 M蛋白
        1.1.2 鏈球菌致熱外毒素B
        1.1.3 GAPDH
        1.1.4 NADase
        1.1.5 CovRS雙組份系統(tǒng)
    1.2 化膿性鏈球菌溶血素O
        1.2.1 SLO基因與表達(dá)
        1.2.2 SLO的蛋白結(jié)構(gòu)
        1.2.3 溶血素介導(dǎo)的轉(zhuǎn)位作用(Cytolysin-mediated translocation,CMT)
    1.3 研究?jī)?nèi)容和意義
    1.4 技術(shù)路線
第2章 SLO重組蛋白及其多克隆抗體的制備
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 試劑與儀器
        2.1.2 培養(yǎng)基與溶液
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 重組SLO表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.1.1 目的基因的PCR
            2.2.1.2 重組質(zhì)粒的連接與轉(zhuǎn)化
        2.2.2 重組SLO的誘導(dǎo)表達(dá)
        2.2.3 重組蛋白的純化
        2.2.4 動(dòng)物免疫與多克隆抗體血清制備
        2.2.5 抗體效價(jià)分析
        2.2.6 Western Blot分析多克隆抗體
    2.3 結(jié)果與討論
        2.3.1 SLO表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)
        2.3.2 SLO重組蛋白純化與溶血活性分析
        2.3.3 抗體的制備和Elisa評(píng)價(jià)多克隆抗體效價(jià)
        2.3.4 多克隆抗體的Western Blot鑒定
    2.4 本章小結(jié)
第3章 化膿性鏈球菌溶血素O基因突變株的構(gòu)建
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種、質(zhì)粒和蛋白
        3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        3.1.3 培養(yǎng)基與溶液
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 DNA的提取與目標(biāo)基因的PCR
        3.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        3.2.3 化膿性鏈球菌突變株的構(gòu)建
        3.2.4 突變株的驗(yàn)證
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 重組敲出質(zhì)粒的鑒定
        3.3.2 突變株的染色體slo基因PCR鑒定
        3.3.3 突變株的SLO蛋白缺失驗(yàn)證
    3.4 本章小結(jié)
第4章 SLO基因突變對(duì)GAS毒力的影響
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株菌種
        4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
        4.1.3 培養(yǎng)基與試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 slo基因突變對(duì)GAS生長(zhǎng)的影響
        4.2.2 NADase的活性測(cè)定
        4.2.3 GAPDH活性測(cè)定
        4.2.4 slo基因突變對(duì)鏈球菌致熱外毒素B的影響
        4.2.5 slo基因突變對(duì)GAS毒力的影響
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 slo基因突變對(duì)GAS生長(zhǎng)的影響
        4.3.2 slo基因突變對(duì)NADase活性影響
        4.3.3 slo基因突變對(duì)細(xì)胞表面GAPDH活性影響
        4.3.4 slo基因突變對(duì)對(duì)SpeB的影響
        4.3.5 slo基因突變對(duì)GAS對(duì)細(xì)胞的粘附的影響
        4.3.6 slo基因突變對(duì)化膿性鏈球菌改變宿主細(xì)胞通透性能力的影響
    4.5 本章小結(jié)
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及科研成果


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]鏈球菌烯醇化酶與致熱外毒素B成熟的相關(guān)性[J]. 胡珊,馬超,李學(xué)如,黎明,劉彥宏,江南屏,郭泰林,姚寧.  高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào). 2013(04)
[2]鏈球菌致熱外毒素SpeB致病性研究進(jìn)展[J]. 張波,李學(xué)如,江南屏,任瑤瑤.  中國(guó)感染控制雜志. 2012(04)
[3]關(guān)注國(guó)內(nèi)兒科A族鏈球菌的分型和耐藥狀況[J]. 姚開(kāi)虎.  中國(guó)實(shí)用兒科雜志. 2012(04)
[4]A群鏈球菌利用人纖溶酶原的機(jī)制[J]. 許麗萍,李培峰,韓潤(rùn)林.  生命的化學(xué). 2010(03)
[5]酪素平板法檢測(cè)臨床分離A族鏈球菌致熱外毒素B活性研究[J]. 李學(xué)如,李堯,王艷,姚寧,郭泰林,孟濤.  中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志. 2009 (06)

碩士論文
[1]化膿性鏈球菌htrA與蛋白分泌相關(guān)性初步研究[D]. 胡珊.西南交通大學(xué) 2013
[2]腸出血性大腸桿菌O157:H7 TccP蛋白表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備和應(yīng)用研究[D]. 楊琴.重慶醫(yī)科大學(xué) 2007



本文編號(hào)：3649067