本文關(guān)鍵詞：沙門菌毒力基因spvB抑制細胞自噬的分子機制及對斑馬魚感染模型的影響，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:沙門菌(Salmonella)是寄生在人和動物腸道內(nèi)可引起多種疾病的腸道致病菌,主要經(jīng)水和食物傳播。沙門菌質(zhì)粒毒力基因(Salmonella plasmid virulence gene,spv)與細菌毒力密切相關(guān),其毒力表型主要由三個區(qū)域介導(dǎo),包括調(diào)節(jié)基因spv R、效應(yīng)基因spv B和spv C。文獻報道spv B的編碼產(chǎn)物具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性,可誘導(dǎo)細胞骨架解聚。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)spv B可抑制宿主細胞自噬體的形成,但相關(guān)的分子機制尚不清楚。本研究第一部分以人宮頸癌上皮細胞He La(human epithelial cell line)為感染模型,通過自噬通量和自噬體形成過程與細胞骨架的相互作用為研究點,探究spv B影響自噬體形成的分子機制。第二部分建立斑馬魚感染模型,深入研究在動物體內(nèi)spv B基因?qū)ι抽T菌感染后腸道上皮細胞自噬及感染結(jié)局的影響,揭示沙門菌毒力基因的致病機制,為治療和控制腸道感染性疾病提供新思路。方法:一.沙門菌毒力基因spv B抑制細胞自噬的分子機制本課題第一部分選用鼠傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium,S.typhimurium,STM)野生株STM-WT(攜帶沙門菌毒力基因spv B)、突變株STM-Δspv B(消除spv B基因)和回補株STM-c-Δspv B(利用重組載體將spv B導(dǎo)入Δspv B)分別感染He La細胞,建立體外細胞感染模型,進行下面實驗:1.透射電子顯微鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)收集感染后1 h和2 h的細胞,制作超薄切片,用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察三株菌感染He La后細胞的超微結(jié)構(gòu),比較感染不同時間點細胞內(nèi)自噬體的形成及細菌的侵襲情況。2.共聚焦激光顯微鏡觀察LC3點狀聚集用m RFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染He La細胞,細菌與細胞共作用1 h后,在共聚焦激光顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)下觀察細菌感染后細胞內(nèi)LC3的點狀聚集;利用自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和自噬抑制劑巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1,Baf)預(yù)處理,比較不同感染組之間黃色LC3的點狀凝集顆粒的數(shù)目,以及藥物干預(yù)前后LC3點狀凝集顆粒的變化。3.共聚焦激光顯微鏡觀察細胞骨架、蛋白與細菌的共定位將細胞鋪入含小圓玻片的24孔板中,于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,分別轉(zhuǎn)染EGFP-Beclin-1、EGFP-Atg14和p GFP-ZFYVE 1質(zhì)粒,與細菌共作用1 h后,用鬼筆環(huán)肽(phalloidin)染色細胞骨架,呈現(xiàn)紅色,利用沙門菌特異性抗體與熒光二抗結(jié)合后對細菌進行著色,將細菌標記為藍色,借助共聚焦激光顯微鏡觀察細胞骨架、蛋白與細菌三者的共定位。4.熒光顯微鏡下觀察p62與感染細菌共定位收集感染后1 h的細胞,抗體孵育后,熒光顯微鏡下觀察各感染組中細菌與p62蛋白共定位情況,計算共定位的細菌占侵入細胞內(nèi)細菌總數(shù)的百分比。5.Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白和p70S6K磷酸化的水平收集感染后1 h和2 h的細胞,采用蛋白免疫印跡(Western blot,WB)法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3,p62和Beclin-1的表達水平;在RAPA和Baf藥物干預(yù)后,觀察不同感染組之間自噬相關(guān)蛋白表達水平的變化。收集感染后1 h和3 h的細胞,Western blot法檢測m TOR信號通路下游p70S6K蛋白表達水平,分析各不同感染組之間磷酸化表達水平的變化。6.平板計數(shù)法計算胞內(nèi)活菌數(shù)收集感染感染后30 min、1 h、3 h和5 h的He La細胞,計算細胞胞內(nèi)菌落形成單位(colony-forming unit,CFU)。平板菌落計數(shù)法分別記錄不同感染組中胞內(nèi)菌的個數(shù)。二.沙門菌毒力基因spvB對斑馬魚感染模型自噬和腸道病變的影響由于回補株STM-c-Δspv B需用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)才能表達,不適合用于體內(nèi)實驗,所以本課題第二部分只選用鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-Δspv B作為體內(nèi)實驗菌株。1.構(gòu)建斑馬魚腸道感染模型選取受精后5 dpf(days post-fertilization,dpf)的斑馬魚幼魚,用Holtfreter buffer將菌液稀釋至1×109 cfu/ml、1×108 cfu/ml、1×107 cfu/ml、1×106 cfu/ml、1×105 cfu/ml、1×104 cfu/ml,采用浸染法感染6 hpi(hours post infection,hpi)后,將斑馬魚放入Holtfreter buffer中,統(tǒng)計感染后7 d斑馬魚的死亡數(shù)目,繪制存活率曲線,計算半數(shù)致死量(median lethal dose,LD50)以確定感染最適濃度及不同菌株對斑馬魚生存的影響。2.平板菌落計數(shù)法分析細菌在斑馬魚體內(nèi)的侵襲及播散能力收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi幼年斑馬魚,利用平板菌落計數(shù)法計算斑馬魚全魚體內(nèi)細菌量,同時進行阿米卡星(Amikacin,AMK)殺菌實驗,計數(shù)殺死胞外菌后,入侵到斑馬魚胞內(nèi)的活菌數(shù),檢測細菌的播散能力及體內(nèi)繁殖情況。3.檢測斑馬魚體內(nèi)自噬水平收集感染不同時間點的斑馬魚,檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達,比較鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-Δspv B隨感染時間的延長,斑馬魚體內(nèi)自噬水平的變化;用透射電子顯微鏡觀察兩株菌在72 hpi斑馬魚腸道超微結(jié)構(gòu)的變化及體內(nèi)自噬體結(jié)構(gòu)的形成。4.斑馬魚感染后腸道的病理學改變及凋亡水平測定用鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-Δspv B分別感染5 dpf斑馬魚,比較兩株菌感染不同時間點對斑馬魚腸道的影響,普通光學顯微鏡觀察斑馬魚腸腔的變化;病理切片HE染色觀察腸道粘膜的病理學改變;用Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達,同時采用實時熒光定量PCR(q RT-PCR)檢測斑馬魚體內(nèi)凋亡調(diào)控基因bcl-2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平。5.檢測沙門菌感染斑馬魚后體內(nèi)炎癥反應(yīng)及巨噬細胞的吞噬功能分別取6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi的斑馬魚觀察細菌感染對斑馬魚炎癥反應(yīng)的影響。q RT-PCR檢測TNFα,IL-1β,IL-22和IL-10的m RNA水平。中性紅染色法檢測斑馬魚體內(nèi)在不同感染組中隨感染時間的延長巨噬細胞吞噬功能的變化。結(jié)果:一.沙門菌毒力基因spv B抑制細胞自噬的分子機制1.spv B抑制自噬體形成:用TEM觀察STM感染后He La細胞的超微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示突變株STM-Δspv B感染后1 h出現(xiàn)典型雙層膜自噬體結(jié)構(gòu),隨著感染時間的延長,在感染后2 h出現(xiàn)單層膜的自噬溶酶體結(jié)構(gòu),其內(nèi)包裹著細胞器和一些待降解的物質(zhì)成分,而在野生株STM-WT和回補株STM-c-Δspv B感染組中未見到自噬體形成,但可觀察到含沙門菌囊泡(Salmonella-containing vacuoles,SCV)和胞內(nèi)菌明顯增多,且隨感染時間的延長,細菌數(shù)量顯著增加。2.spv B抑制自噬體形成的早期階段:用m RFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染He La細胞,通過CLSM觀察LC3點狀凝集,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株STM-Δspv B感染組中黃色LC3點狀聚集明顯多于攜帶spv B基因的STM感染組,且突變株感染組中藍色細菌周圍存在黃色LC3點狀聚集。經(jīng)RAPA和Baf藥物干預(yù)后,結(jié)果顯示,突變株STM-Δspv B感染組中黃色LC3點狀聚集仍然多于其他兩組攜帶spv B基因的感染組,且藍色細菌周圍存在黃色LC3的聚集。3.spv B影響自噬相關(guān)蛋白表達:Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白LC3,p62及Beclin-1的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變株STM-Δspv B感染組中胞漿型LC3(即LC3-I)向膜型(即LC3-II)的轉(zhuǎn)化量顯著高于野生株STM-WT和回補株STM-c-Δspv B感染組,Beclin-1的表達水平明顯高于其他感染組,而自噬底物蛋白p62表達水平顯著低于其他感染組。RAPA處理后,STM-Δspv B感染組中LC3的轉(zhuǎn)化量和Beclin-1均有所增加,p62則較其他各組有明顯下降。Baf干預(yù)后,各感染組中LC3的轉(zhuǎn)化量顯著增加,p62表達量也較其他各干預(yù)組有顯著增加,STM-Δspv B感染組中LC3的轉(zhuǎn)化量、Beclin-1和p62表達水平均高于STM-WT和STM-c-Δspv B。4.spv B抑制p62與胞內(nèi)菌的共定位:利用免疫熒光法檢測p62與感染細菌共定位,在熒光顯微鏡下觀察,突變株STM-Δspv B感染組中p62點狀聚集較其他感染組顯著增多,且p62與細胞內(nèi)感染細菌的共定位明顯增加,而在STM-WT和STM-c-Δspv B感染組中僅發(fā)現(xiàn)有少量的p62與細胞內(nèi)感染細菌共定位。5.通過CLSM觀察細菌與細胞骨架及蛋白的共定位:結(jié)果顯示STM-WT和STM-c-Δspv B感染后1 h可誘導(dǎo)He La細胞中F-Actin肌動蛋白絲解聚,同時Beclin-1、Atg14和ZFYVE 1蛋白表達量顯著降低,在突變株STM-Δspv B感染組中,細胞肌動蛋白絲結(jié)構(gòu)明顯,且細菌分別與Beclin-1、Atg14和ZFYVE 1蛋白發(fā)生共定位。6.spvB通過mTOR信號通路抑制宿主細胞自噬:Western blot檢測磷酸化p70S6K蛋白,結(jié)果顯示突變株STM-Δspv B感染后1 h,p70S6K磷酸化水平較其他感染組明顯降低,這種現(xiàn)象在感染后3 h仍然存在。7.spv B可促進細菌在胞內(nèi)的繁殖:胞內(nèi)CFU計數(shù),結(jié)果顯示在感染后1 h胞內(nèi)CFU即出現(xiàn)差異,感染后3 h出現(xiàn)STM-Δspv B感染組胞內(nèi)CFU顯著低于STM-WT和STM-c-Δspv B感染組,這種差異在感染后5 h更加顯著。二.沙門菌毒力基因spv B對斑馬魚感染模型自噬和腸道病變的影響1.建立斑馬魚腸道感染模型:STM感染5 dpf的斑馬魚建立體內(nèi)感染模型,通過記錄7 d內(nèi)感染不同劑量間斑馬魚的死亡和存活率,確定1×108 cfu/ml為感染最適菌量,并繪制生存曲線及計算半數(shù)致死量LD50,結(jié)果顯示斑馬魚死亡數(shù)量隨感染濃度的遞減而減少,隨感染時間的延長而增加。用Reed-Muench法計算STM-WT和STM-Δspv B對斑馬魚的致病性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)STM-WT的LD50為1.33×106cfu/ml,STM-Δspv B的LD50為2.22×106cfu/ml,說明spv B可顯著降低沙門菌對斑馬魚的LD50。2.觀察STM在斑馬魚體內(nèi)的播散及繁殖情況:采用平板菌落計數(shù)法記錄STM感染后斑馬魚體內(nèi)細菌的侵襲、播散及繁殖能力,結(jié)果顯示斑馬魚體內(nèi)感染細菌菌量隨感染時間的延長而成指數(shù)增加;加入阿米卡星(Amikacin,AMK)作用后,發(fā)現(xiàn)各組細菌菌量均有所減少,在72 hpi斑馬魚體內(nèi)感染鼠傷寒沙門菌STM-WT的菌量顯著高于感染STM-Δspv B,這種差異在120 hpi更加明顯,說明spv B具有促進細菌入侵,增強細菌繁殖的能力。3.檢測沙門菌感染對斑馬魚體內(nèi)自噬的影響:收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi的斑馬魚,檢測自噬相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1和P62的表達,結(jié)果顯示突變株STM-Δspv B在72 hpi LC3的轉(zhuǎn)化量顯著高于攜帶spv B的STM感染組,Beclin-1的表達水平明顯高于其他感染組,而自噬底物蛋白p62表達水平顯著低于其他感染組。用TEM觀察沙門菌感染72 hpi斑馬魚腸道超微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示突變株STM-Δspv B感染組中斑馬魚腸道組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)。野生株STM-WT感染組中可看到大量的沙門菌入侵斑馬魚腸道上皮粘膜層,且腸道微絨毛排列紊亂,甚至出現(xiàn)脫落現(xiàn)象且腸道柱狀上皮細胞結(jié)構(gòu)不清晰。4.觀察沙門菌感染后斑馬魚腸道的形態(tài)學改變及凋亡水平測定:通過普通光學顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),野生株STM-WT感染組中,斑馬魚腸道隨感染時間的延長腸腔變窄,腸道內(nèi)容物模糊不清,腸腔內(nèi)面積減少,而突變株STM-Δspv B感染組中,斑馬魚腸道病變明顯較野生株輕。病理切片后HE染色觀察發(fā)現(xiàn),隨感染時間的延長斑馬魚腸道上皮微絨毛排列紊亂,在120 hpi腸腔內(nèi)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤,突變株STM-Δspv B感染組中斑馬魚腸道病變較野生株輕,但也觀察到不同程度的腸腔狹窄和炎性細胞浸潤。Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn)120 hpi STM-WT感染組中Bcl-2表達顯著低于STM-Δspv B感染組,同時采用q RT-PCR檢測bcl-2的m RNA轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)在120 hpi野生株STM-WT感染組中bcl2表達顯著低于突變株STM-Δspv B感染組。5.沙門菌感染后斑馬魚體內(nèi)炎癥反應(yīng)及吞噬細胞的吞噬功能:利用實時熒光定量PCR分析TNFα,IL-1β,IL-22和IL-10在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果顯示STM-WT感染組中以上基因m RNA轉(zhuǎn)錄水平隨感染時間的延長而逐漸升高,在感染后6 h STM-WT和STM-Δspv B感染組中斑馬魚體內(nèi)炎癥的標志性基因表達水平并無顯著性差異,感染后120 h STM-Δspv B感染組中炎癥的標志性基因的表達顯著低于STM-WT感染組。沙門菌感染誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)固有免疫應(yīng)答,中性紅染色法檢測斑馬魚感染后巨噬細胞吞噬能力,分別收集6 hpi、24 hpi、72 hpi和120 hpi四個時間點感染鼠傷寒沙門菌STM-WT和STM-Δspv B的斑馬魚,采用中性紅染色液對斑馬魚體內(nèi)巨噬細胞進行染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著感染時間的延長,各感染組中斑馬魚體內(nèi)巨噬細胞吞噬功能均不斷升高,兩組細菌感染后巨噬細胞吞噬功能未見明顯差異。結(jié)論:1.spvB基因通過解聚細胞骨架從而抑制細胞自噬體形成。2.spvB基因產(chǎn)物通過激活mTOR信號通路從而抑制宿主細胞自噬體形成。3.spv B基因可增強細菌毒力,加強對斑馬魚腸道的致病性,影響斑馬魚體內(nèi)自噬水平,誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)炎癥反應(yīng),對巨噬細胞吞噬功能未見顯著影響。
【關(guān)鍵詞】：鼠傷寒沙門菌 沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB 自噬 斑馬魚
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文提要4-10
• Abstract10-19
• 引言19-23
• 第一部分 沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對HeLa細胞自噬的影響23-44
• 1.材料與方法24-30
• 2. 結(jié)果30-42
• 3.討論42-44
• 第二部分 沙門菌質(zhì)粒毒力基因spvB對斑馬魚自噬水平及體內(nèi)感染過程的影響44-64
• 1. 材料與方法45-48
• 2.結(jié)果48-61
• 3.討論61-64
• 小結(jié)64-65
• 參考文獻65-70
• 綜述70-82
• 參考文獻78-82
• 攻讀學位期間本人出版或公開發(fā)表的論著、論文82
• 本課題所獲的基金資助82-83
• 學術(shù)會議報告83-84
• 英文縮略詞表84-85
• 致謝85-86

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1 李潔斐,李衛(wèi)華,金泰^

本文編號：364440