目的制備結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）分泌蛋白Rv0674,篩選與Rv0674蛋白特異性結合的肽分子。方法用PCR從MTB（H37Rv）基因組中擴增出Rv0674基因�？寺〉絧EASY-E1表達載體上,將測序驗證正確的重組表達質粒轉化入E. coli BL21中,用IPTG誘導蛋白表達,Ni2+親和層析法純化目的蛋白。通過SDS-PAGE和Western blot鑒定后,將純化后的Rv0674蛋白包被到96孔板上,再利用噬菌體展示技術,經過連續(xù)4輪特異性親和篩選,對第4輪產物隨機挑取單獨的噬菌斑,提取基因組并測序,用SnapGene 4.1.4比對并翻譯多肽的基因序列。結果構建了Rv0674序列正確的重組表達質粒,獲得分子量約為26.5kD的可溶性Rv0674蛋白。從第4輪的洗脫物中,隨機挑選40個噬菌斑。測序結果可翻譯成10種多肽分子,其中重復19次的多肽序列為TSTMMMHMNL。結論通過噬菌體展示技術篩選到TSTMMMHMNL多肽序列,對Rv0674蛋白的親和力和特異性最好。 

【文章來源】：寧夏醫(yī)科大學學報. 2019,41(06)

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【部分圖文】：

淘選噬菌體滴度圖

與預期大小為780bp的Rv0674結果相符，見圖1。2.2Rv0674的純化純化的Rv0674蛋白經SDS-PAGE鑒定，獲得了大量的高純度的可溶性蛋白質，其分子量略大于25kDa，與Rv0674預測的分子量26.5kDa一致，見圖2。2.3Rv0674特異性結合肽篩選2.3.1滴度測定以Rv0674為靶分子，每輪篩選后對收集到的噬菌體進行滴度測定，見圖3。2.3.24輪篩選結果以Rv0674為靶分子，使噬菌體表面展示的隨機多肽與之結合，經4輪“吸附-淘洗-洗脫-擴增”后，第3輪得到的是第2輪的36.4倍，第4輪是第3輪的4倍；提示噬菌體得到明顯富集，見表1。2.4篩選結果從第4輪產物中隨機挑取40個噬菌體單克隆進行核苷酸序列測定，結果表明2、3、4、5、10、13、17、19、20、21、22、25、26、27、28、29、32、35、36號共19個噬菌體所攜帶的核苷酸序列和翻譯出的多肽氨基序列相同，分別為ACCTCCACCAT－GATGATGCATATGAATCTT和TSTMMMHMNL，該類多肽實現(xiàn)了富集。同時也篩選到了其他9種多肽，提示這些多肽可能對Rv0674蛋白的親和力和特異性比較好，見表2。3討論TB是由MTB引起的危害全球人類健康的重大傳染性疾病之一，目前在用于臨床TB診斷的幾種方法中，雖然細菌學診斷一直是TB診斷的金標準[9]，但耗時長，假陽性率高[10]。而血清學診斷簡單、快速、高效、低廉，成為近幾年來研究的熱點[11]，但單一的抗原檢測往往不能同時滿足高靈敏性和特異性的要求[12]。研究[13]發(fā)現(xiàn)，通過MTB分泌蛋白抗原T細胞表位展示的外源性多肽分子，將其應用于TB的血清學診斷，能夠滿足快速、靈敏的診斷要求。感染MTB的病人，在出現(xiàn)臨床癥狀前幾個月甚至幾年就存在MTB分泌抗原的抗體。因此MTB分泌性蛋白的相關研究引起了越來越多的人關注，對多種分泌性蛋白如ESAT-6[14]

【參考文獻】：
期刊論文
[1]表達結核分枝桿菌ESAT-6-Ag85A基因的侵入型乳酸菌免疫特性研究[J]. 劉晶,張贊,劉洋,楊桂連,姜延龍,王春鳳.  中國免疫學雜志. 2019(01)
[2]結核分枝桿菌分泌蛋白調控巨噬細胞自噬誘導持續(xù)性感染[J]. 張彩勤,楊麗,張廷芬,師長宏.  科學技術與工程. 2018(32)
[3]噬菌體展示技術在藥物研發(fā)中的應用[J]. 侯雪瑩,胡卓偉,崔冰.  藥學學報. 2018(08)
[4]結核分枝桿菌MPT64蛋白多克隆抗體的制備[J]. 李國濤,臧珂.  應用預防醫(yī)學. 2017(04)
[5]Rv2031c、38kDa及融合蛋白CFP10-ESAT6用于結核病血清學診斷的評價[J]. 余琴,林楠,張愛潔,徐偉,劉英杰,萬康林.  中國病原生物學雜志. 2017(05)
[6]結核分枝桿菌ESX-1分泌蛋白EspB結構和功能分析[J]. 唐曉萌,王大成.  生物化學與生物物理進展. 2017(05)
[7]結核分枝桿菌Rv3803c、Rv3846基因的克隆、表達、純化與鑒定[J]. 孫毅凡,李海成,周杰,錢明,陳濤,江勇,賴賽麟,江振友,鐘球,周琳.  中國防癆雜志. 2012(08)

博士論文
[1]十六個結核分枝桿菌新抗原的抗原表位鑒定與評價[D]. 王雪枝.中國疾病預防控制中心 2017

碩士論文
[1]結核分枝桿菌模擬表位的篩選及其在結核病血清學診斷中的初步應用[D]. 王麗.南華大學 2017
[2]結核分枝桿菌分泌蛋白的預測研究[D]. 楊歡.電子科技大學 2017
[3]結核分枝桿菌人新B細胞表位及10種特異蛋白的抗原性研究[D]. 徐永娟.南華大學 2016



本文編號：3636891