發(fā)布時間：2022-01-20 09:07

　　目的:采用酵母雙雜交技術(shù),篩選PRR11的相互作用蛋白,為深入研究其分子行為機制奠定基礎。方法:構(gòu)建用于酵母雙雜交篩選的PRR11誘餌質(zhì)粒并檢測其自激活作用,根據(jù)結(jié)果進一步構(gòu)建突變體獲得具有較低自激活作用的突變體。對人胎腦cDNA文庫進行篩選,獲得初始陽性克隆。通過LacZ報告基因檢測、回轉(zhuǎn)驗證、陽性克隆測序及BLAST序列比對分析,排除假陽性克隆和重復克隆,確定PRR11的候選相互作用蛋白。結(jié)果:PRR11具有自激活作用,構(gòu)建了一個較低自激活作用的PRR11突變體。通過酵母雙雜交篩選,獲得102個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子。經(jīng)LacZ報告基因檢測,將陽性克隆鎖定至39個。通過測序和序列比對分析,證實這39個克隆屬于編碼15種不同蛋白的基因。最終有RNF41等4個蛋白通過回轉(zhuǎn)驗證。結(jié)論:RNF41、SCG5、BCYRN1和PRR13是PRR11的潛在相互作用蛋白。 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學學報. 2019,44(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：6 頁

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 誘餌載體的構(gòu)建和鑒定
        1.2.2 PRR11及其突變體自激活檢測
        1.2.3 篩選文庫用3-AT濃度確定
        1.2.4 酵母雙雜交文庫篩選
        1.2.5陽性克隆鑒定
        1.2.6 酵母陽性克隆DNA提取和測序比對
        1.2.7 陽性克隆回轉(zhuǎn)驗證
2 結(jié)果
    2.1 誘餌載體的構(gòu)建
    2.2 重組誘餌蛋白自激活檢測和功能檢測
    2.3 PRR11突變體構(gòu)建及自激活檢測
    2.4 文庫篩選和陽性克隆鑒定
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