發(fā)布時(shí)間：2021-09-30 02:56

　　目的運(yùn)用CRISR/Cas9技術(shù)敲除小鼠基因組中Bmp9基因片段,構(gòu)建Bmp9基因敲除小鼠。方法根據(jù)Bmp9基因的外顯子序列,設(shè)計(jì)一段sgRNA并合成。sgRNA體外轉(zhuǎn)錄后和Cas9 mRNA混合后顯微注射受精卵細(xì)胞,注射后的受精卵細(xì)胞移植至受體動(dòng)物獲得子代小鼠。提取子代小鼠基因組DNA測(cè)序鑒定其基因型�；蛐丸b定正確的小鼠與野生型交配后篩選純合子小鼠。同時(shí)取純合子小鼠心臟、肝、脾、肺、腎,勻漿后提取總RNA和總蛋白,通過(guò)q PCR、WB和免疫組化檢測(cè)BMP9在各組織中的表達(dá)。結(jié)果設(shè)計(jì)并合成20 bp的sgRNA并進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,顯微注射并回植后得到基因突變小鼠,連續(xù)交配后得F2代純合子。測(cè)序結(jié)果顯示,突變小鼠存在兩種基因型,一種為5 bp缺失突變,另一種為13 bp缺失并伴有1 bp插入突變。與野生型C57BL/6相比,q PCR、WB和免疫組化結(jié)果均表明基因敲除小鼠肝中BMP9表達(dá)顯著降低。結(jié)論利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建出了BMP9基因敲除小鼠。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào). 2019,27(03)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料
        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.1.2 試劑與儀器
    1.2 方法
        1.2.1 sgRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        1.2.2 體外轉(zhuǎn)錄
        1.2.3 顯微注射及胚胎移植
        1.2.4 基因型鑒定和純合子的篩選
        1.2.5 BMP9在肝組織中的表達(dá)
2 結(jié)果
    2.1 構(gòu)建質(zhì)粒及體外轉(zhuǎn)錄
    2.2 基因型鑒定
    2.3 BMP9在敲除小鼠肝組織中的表達(dá)
        2.3.1 BMP9 mRNA和蛋白在敲除小鼠中的表達(dá)
        2.3.2 免疫組化
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