目的:原核表達(dá)柯薩奇病毒B組5型的VP1蛋白,并制備其多克隆抗體及檢測(cè)。方法:提取在Vero細(xì)胞中柯薩奇病毒B組5型的RNA,通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增獲取VP1基因序列,構(gòu)建原核表達(dá)載體,大量誘導(dǎo)表達(dá)重組VP1蛋白。用His Trap HP親和層析柱純化重組蛋白,以純化的目的蛋白為抗原,免疫雄性SD大鼠獲得VP1蛋白多克隆抗體血清,ELISA測(cè)定該抗體的效價(jià),微量中和實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗體的中和活性,Western blot檢測(cè)抗體的特異性,免疫組化檢測(cè)抗體對(duì)組織中抗原的識(shí)別。結(jié)果:成功構(gòu)建了VP1-pET-28a重組載體,并且在BL21細(xì)胞中成功誘導(dǎo)表達(dá),親和層析柱純化后蛋白純度大于90%。ELISA測(cè)得抗體的效價(jià)為1∶128 000,微量中和實(shí)驗(yàn)顯示抗體沒(méi)有中和活性,Western blot分析顯示抗體能與CVA16和EV71交叉反應(yīng),免疫組化實(shí)驗(yàn)表明抗體能夠識(shí)別組織中的CVB5抗原。結(jié)論:本研究成功制備了CVB5 VP1蛋白的高效價(jià)的多克隆抗體,為CVB5病毒疫苗和病毒診斷的研發(fā)提供了有效的工具。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2019,35(04)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：4 頁(yè)

【部分圖文】：

VP1片段擴(kuò)增及重組載體的驗(yàn)證Fig．1AmplificationofVP1fragmentandverificationof

圖4抗體對(duì)CVA16和EV71的交叉識(shí)別能力Fig．4CrossrecognitionabilityofantibodytoCVA16andEV71圖5抗體識(shí)別腦組織CVB5抗原的免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig．5ImmunohistochemicalstainingresultsofCVB5an-tigenidentifiedbyantibodyinbraintissue(×200)陰性血清做對(duì)照。圖5A為對(duì)照組片子，其中沒(méi)有棕色顆粒物，而實(shí)驗(yàn)組中則有明顯的棕色顆粒，即圖5B中箭頭所指示，表明制得的抗體可用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。3討論近年來(lái)CVB5在世界范圍內(nèi)開(kāi)始流行，如2006年在法國(guó)有23%的腦膜炎患者確定為CVB5感染［7］;在2003年至2004年，希臘也報(bào)道了CVB5引起的無(wú)菌性腦膜炎的流行［8］;在2005年和2009年，我國(guó)山東和河南也爆發(fā)了CVB5感染引發(fā)的無(wú)菌性腦膜炎［9］。雖然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但腦膜炎的疾病是有后遺癥的。因此，CVB5的抗病毒藥物及疫苗的研究和快速的臨床診斷是非常迫切的。疫苗研究及臨床診斷都需要用特異性抗體來(lái)檢測(cè)病毒抗原。Opanda等［10］的研究表明，CVB5病毒顆粒的主要中和抗原表位位于VP1區(qū)。綜上，本研究將目標(biāo)瞄向了CVB5衣殼亞單位VP1蛋白多克隆抗體的制備。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CVB5VP1基因的原核表達(dá)載體VP1-pET-28a，并將其在BL21細(xì)胞中大量誘導(dǎo)表達(dá)。重組VP1蛋白C、N兩端都有His標(biāo)簽，因此我們利用HisTrapHP親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。純化后的目的蛋白純度大于90%，符合多克隆抗體制備的要求。純化后的目的蛋白與弗氏佐劑混合后，分多次、多位點(diǎn)皮下注射免疫SD大鼠，獲得了VP1

圖4抗體對(duì)CVA16和EV71的交叉識(shí)別能力Fig．4CrossrecognitionabilityofantibodytoCVA16andEV71圖5抗體識(shí)別腦組織CVB5抗原的免疫組化染色結(jié)果(×200)Fig．5ImmunohistochemicalstainingresultsofCVB5an-tigenidentifiedbyantibodyinbraintissue(×200)陰性血清做對(duì)照。圖5A為對(duì)照組片子，其中沒(méi)有棕色顆粒物，而實(shí)驗(yàn)組中則有明顯的棕色顆粒，即圖5B中箭頭所指示，表明制得的抗體可用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。3討論近年來(lái)CVB5在世界范圍內(nèi)開(kāi)始流行，如2006年在法國(guó)有23%的腦膜炎患者確定為CVB5感染［7］;在2003年至2004年，希臘也報(bào)道了CVB5引起的無(wú)菌性腦膜炎的流行［8］;在2005年和2009年，我國(guó)山東和河南也爆發(fā)了CVB5感染引發(fā)的無(wú)菌性腦膜炎［9］。雖然CVB5感染引起的疾病多是自限性的，但腦膜炎的疾病是有后遺癥的。因此，CVB5的抗病毒藥物及疫苗的研究和快速的臨床診斷是非常迫切的。疫苗研究及臨床診斷都需要用特異性抗體來(lái)檢測(cè)病毒抗原。Opanda等［10］的研究表明，CVB5病毒顆粒的主要中和抗原表位位于VP1區(qū)。綜上，本研究將目標(biāo)瞄向了CVB5衣殼亞單位VP1蛋白多克隆抗體的制備。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CVB5VP1基因的原核表達(dá)載體VP1-pET-28a，并將其在BL21細(xì)胞中大量誘導(dǎo)表達(dá)。重組VP1蛋白C、N兩端都有His標(biāo)簽，因此我們利用HisTrapHP親和層析柱對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化。純化后的目的蛋白純度大于90%，符合多克隆抗體制備的要求。純化后的目的蛋白與弗氏佐劑混合后，分多次、多位點(diǎn)皮下注射免疫SD大鼠，獲得了VP1

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]諾如病毒NV衣殼蛋白VP1表達(dá)純化及多克隆抗體的制備[J]. 仉秋實(shí),苑榮亮,井申榮.  中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志. 2017(08)
[2]Etiology, pathogenesis, antivirals and vaccines of hand,foot, and mouth disease[J]. Xiaobo Lei,Sheng Cui,Zhendong Zhao,Jianwei Wang.  National Science Review. 2015(03)



本文編號(hào)：3304173