自從發(fā)現(xiàn)雙鏈21堿基小干擾RNA可以引發(fā)特異性的基因沉寂，雙鏈RNA介導的RNA干擾已經逐漸在抑制基因表達方面得到了廣泛的應用。然而，由于目前廣泛應用的是體外合成RNA轉染細胞的方法；這個方法有合成成本高、轉染效率低、容易降解、不能持續(xù)發(fā)揮作用等缺點。為了解決上述問題，利用人的U6核小RNA（human small nuclear RNA U6，簡稱hsnU6）基因單元的特性，構建了一種可嵌合于U6變體基因內部持續(xù)高效表達小干擾RNA，有效特異地抑制特定基因表達的全新載體系統(tǒng)。應用這套系統(tǒng)，檢測了針對于綠色熒光蛋白基因和CR-1基因不同靶位點的小干擾RNA的作用效果。結果表明，RNA干擾作用效果與RNA二級結構相關。這些發(fā)現(xiàn)使這套DNA載體介導的RNA干擾表達系統(tǒng)能夠在功能基因組研究方面廣泛發(fā)揮作用，并有望成為基因治療大家族中重要的一員。 細胞調控因子-1是由中國醫(yī)學科學院王以光教授獲得專利的一個新基因，GenBank號碼為GI-21703347。與正常組織細胞相比，細胞調控因子-1在多種腫瘤細胞中富集，并且由酵母雙雜交結果得知其與p21等多種蛋白相互作用。應用構建的小干擾RNA... 

【文章來源】：沈陽藥科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：76 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
實驗材料
實驗方法
    1 大腸桿菌質粒DNA小量提取
    2 大腸桿菌質粒DNA大量提取
    3 限制酶切反應
    4 去磷酸化反應
    5 寡核苷酸片段的磷酸化
    6 PCR反應
    7 DNA電泳及片段回收
    8 DNA連接反應
    9 E.coli DH-5α感受態(tài)細胞的制備
    10 質粒DNA轉化E.coli DH-5α
    11 E.coli轉化子的快速鑒定
    12 真核細胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基的配制
    13 RNA抽提及準備
    14 RT-PCR
    15 Northrtn Blot
    16 Western Blot
    17 質粒轉染真核細胞
    18 熒光顯微觀察及拍照
    19 細胞增殖速度測定
    20 測定細胞的周期變化及凋亡
    21 基因組DNA片段化的檢測
    22 真核細胞的凍存
結果與討論
    第一章 小干擾RNA體內高效表達系統(tǒng)的建立及檢測
        一. 小干擾RNA體內高效表達系統(tǒng)的建立
            1 hsnU6RNA基因
            2 hsnU6RNA基因的PCR克隆
            3 U6變體基因的PCR克隆
            4 系統(tǒng)的完成
        二. 所構建的載體系統(tǒng)體外及體內活性鑒定
            1 U6變體RNA表達的體外檢測
            2 RNA干擾的體內活性鑒定
    第二章 RNA干擾方法學的初步探討
        一. RNA干擾靶位點的選擇及重組質粒的構建
            1 RNA干擾靶位點的選擇
            2 重組質粒的構建
        二. RNA干擾不同靶位點的作用效果比較
            1 針對綠色熒光蛋白基因不同靶位點的RNA干擾效果比較
            2 針對CR-1基因不同靶位點的RNA干擾效果比較
    第三章 細胞調控因子-1基因生物功能的研究
        一. 細胞調控因子-1基因(CR-1)表達的下調
            1 抑制CR-1基因的小干擾RNA表達質粒的構建
            2 CR-1基因表達水平的檢測
            3 CR-1基因缺失突變株的篩選和檢測
        二. 細胞調控因子-1基因(CR-1)生物功能的研究
            1 細胞形態(tài)學變化
            2 細胞增殖速度的變化
            3 細胞周期及凋亡的變化
結論
參考文獻
致謝
碩士研究生期間發(fā)表及準備中的文章及專利



本文編號：3243175